Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận dịch Protein thủy phân và Hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hướng ứng dụng trong thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng

Nội dung text: Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận dịch Protein thủy phân và Hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hướng ứng dụng trong thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHẠM VIẾT NAM NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH PROTEIN THỦY PHÂN VÀ HYDROXYAPATITE TỪ PHẾ LIỆU CÁ TRA, ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG THỨC ĂN NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ngành đào tạo: Công nghệ Chế biến Thuỷ sản Mã số: 9540105 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HOÀ – 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG PHẠM VIẾT NAM NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH PROTEIN THỦY PHÂN VÀ HYDROXYAPATITE TỪ PHẾ LIỆU CÁ TRA, ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG THỨC ĂN NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐÀO TẠO: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN MÃ SỐ : 9540105 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trang Sỹ Trung PGS.TS. Nguyễn Văn Hòa KHÁNH HÒA - 2021
3. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết Tiếng Anh Tiếng Việt tắt AOAC Association of Official Hiệp hội các nhà hoá Analytical Chemists phân tích chính thống ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai HA Hydroxyapatite Hydroxyapatite FPH Fish Protein Hydrolysate Dịch protein thủy phân cá DH Degree Hydrolysis Độ thủy phân NR Nitrogen Recovery HIệu suất thu hồi nitơ HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography GPC Gel Permeation Sắc ký thẩm thấu gel Chromatography Nd Not detected Không phát hiện JCPDS 09-0432 Ký hiệu mẫu HA chuẩn FT-IR Fourier Transform Infrared Quang phổ hồng ngoại SEM Scanning Electron Kính hiển vi điện tử quét Microscope TEM Transmission Electron Kính hiển vi điện tử Microscopy truyền qua XPS X-ray Photoelectron Phổ kế quang điện tử tia Spectroscopy X XRF X-Ray Fluorescence Huỳnh quang tia X XRD X-ray diffraction Nhiễu xạ tia X BET Brunauer–Emmett–Teller Brunauer–Emmett–Teller ICP-MS Inductively coupled Hệ thống khối phổ plasma plasma mass spectrometry ghép cặp cảm ứng PL Postlarvae Tôm hậu ấu trùng AA Amino Acid Axít amin DO Dissoved Oxygen Nồng độ ôxi hòa tan trong nước
4. TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Tên luận án: Nghiên cứu thu nhận dịch protein thủy phân và hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hướng ứng dụng trong thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng. Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản. Mã số: 9540105. Nghiên cứu sinh: Phạm Viết Nam Khóa: 2015 - 2019 Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Trang Sĩ Trung 2. PGS.TS. Nguyễn Văn Hòa Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Những đóng góp mới của luận án: 1. Luận án đã công bố số liệu về thành phần hóa học của nguồn phế liệu cá Tra (Pangasius hypophthalmus) tại nhà máy chế biến thủy sản Nam Việt thuộc tỉnh An Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Luận án đã xây dựng được quy trình thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng gồm dịch protein thủy phân, hydroxyapatite, lipít thô từ phế liệu cá Tra. Khi sử dụng alcalase, sản phẩm dịch protein thủy phân thu được có độ thủy phân (DH) gần 35%, với hơn 70% khối lượng phân tử của dịch thủy phân < 1000 Da, có hàm lượng đạm tổng 11,7%, hàm lượng lipít tổng 10,8%. Khi sử dụng enzyme alcalase và lipase, sản phẩm dịch thủy phân thu nhận có hàm lượng đạm tổng 33,2%, hàm lượng lipít tổng 1,93%, hàm lượng đạm axit amin 420,16 mg/g protein. Hydroxyapatite (HA) thu nhận từ xương cá bằng phương pháp xử lý nhiệt có kích thước 50 – 70 nm, tỷ lệ hàm lượng nguyên tố Ca/P là 1,83, diện tích bề mặt của hạt 2,87 m2/g, thể tích lỗ xốp 0,02 m3/g, kích thước lỗ xốp trung bình 1,2 nm và hàm lượng kim loại nặng (Pb, Hg, Cd) không phát hiện. Đây là cách tiếp cận mới nhằm sử dụng toàn bộ nguồn phế liệu cá Tra để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao, đồng thời hướng đến quy trình sản xuất “không chất thải”. 3. Luận án đã bước đầu thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung 5% hỗn hợp vào thức ăn, tôm tăng trưởng 123,5% về khối lượng và 112% về chiều dài so với khi không bổ sung. Việc bổ sung hỗn hợp này không ảnh hưởng đến môi trường nước nuôi tôm. Đây là cơ sở để ứng dụng hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm.
5. TM giáo viên hướng dẫn Nghiên cứu sinh PGS.TS. Trang Sĩ Trung Phạm Viết Nam
6. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Cá Tra (Pangasius Hypophthalmus) là một trong hai sản phẩm thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Tổng diện tích nuôi cá Tra của Việt Nam tăng nhanh từ năm 2015 là 5.500 ha lên 7.127 ha năm 2019 tương ứng với sản lượng cá Tra thu hoạch đạt 1 triệu tấn tăng lên 1,52 triệu tấn. Tổng giá trị xuất khẩu tăng từ 1,57 tỷ USD năm 2015 lên đạt 2 tỷ USD năm 2019, đóng góp 23,26% vào giá trị xuất khẩu của ngành Thủy sản [14]. Hầu hết các sản phẩm cá Tra xuất khẩu dưới dạng cá Tra phi-lê đông lạnh. Tuy nhiên, khối lượng cá Tra phi-lê chỉ chiếm khoảng 40%, do đó khoảng 60% là phế liệu cá gồm đầu, vây, khung xương, nội tạng, da, thịt vụn [86,93,103,138]. Đây là nguồn phế liệu khổng lồ và nếu không có cách giải quyết phù hợp thì sẽ gây lãng phí tài nguyên và ô nhiễm môi trường. Ở nước ta hiện nay, phế liệu cá Tra chủ yếu vẫn được dùng để sản xuất bột cá với công nghệ đơn giản như hấp, sấy và nghiền. Sản phẩm này thường dùng làm thức ăn chăn nuôi có giá trị kinh tế và chất lượng thấp. Trong khi đó, phế liệu cá có chứa nhiều hợp chất có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao như protein, khoáng, lipít, Các hợp chất này có thể được dùng để sản xuất ra các sản phẩm thức ăn có giá trị kinh tế cao dùng trong chăn nuôi, thậm chí có thể sử dụng làm thực phẩm cho con người. Do đó, việc nghiên cứu thu nhận các hợp chất có giá trị gia tăng từ phế liệu cá Tra là rất cần thiết. Gần đây, đã có nhiều công trình nghiên cứu thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phế liệu cá bằng phương pháp khác nhau. Tuy vậy, các công trình này thường chỉ sử dụng một phần trong phế liệu cá để thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng. Cụ thể, một số tác giả tập trung thu nhận dịch thủy phân protein và lipít từ phần hữa cơ của phế liệu cá mà bỏ qua phần khoáng chất (chủ yếu hydroxyapatite, HA) từ phần xương cá. Ngược lại, một số tác giả chỉ thu nhận HA từ xương cá, bỏ qua phần protein và lipít có trong phế liệu cá. Việc sử dụng một phần phế liệu cá vừa gây lãng phí tài nguyên, vừa có khả năng gây ô nhiễm môi trường hoặc phát sinh chi phí xử lý chất thải. Ở nước ta, lượng phế liệu cá Tra lớn thải ra từ các dây chuyền chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh tại các nhà máy chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh tại một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, như: 1
7. Nam Việt, Vĩnh Hoàn, Hùng Cá Nguồn phế liệu này chủ yếu làm nguyên liệu cho các Nhà máy sản xuất bột cá và được dùng làm thức ăn chăn nuôi có giá trị kinh tế thấp, chất lượng ding dưỡng không cao. Do đó, việc nghiên cứu quy trình phù hợp để thu nhận các sản phẩm có giá trị cao từ toàn bộ phần phụ phẩm còn lại của cá Tra, đồng thời thử nghiệm ứng dụng các sản phẩm thu nhận được trong lĩnh vực nông nghiệp tại Việt Nam là rất cần thiết. Từ các nhận định trên, tác giả đề xuất “Nghiên cứu thu nhận dịch protein thủy phân và hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hướng ứng dụng trong thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng”. Đề tài định hướng thu nhận đồng thời các sản phẩm giá trị gia tăng như dịch thủy phân protein, hydroxyapatite, lipít từ phế liệu cá Tra và thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và HA vào thức ăn tôm thẻ chân trắng. Kết quả của đề tài sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế của sản phẩm cá Tra Việt Nam, giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trường, đồng thời cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng cho thức ăn tôm. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng được quy trình thu nhận dịch protein thủy phân và hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra sau phi-lê. - Bước đầu ứng dụng thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. 3. Phạm vi và nội dung nghiên cứu Luận án tập trung nghiên cứu, đánh giá, làm rõ các nội dung: - Xác định thành phần hóa học, thành phần khối lượng của phế liệu cá Tra. - Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu cá Tra đạt độ thủy phân và hiệu suất thu hồi nitơ cao nhất theo 2 giai đoạn, gồm: Giai đoạn 1: nguyên liệu phế liệu cá Tra, hàm lượng enzyme alcalase, nhiệt độ, thời gian thủy phân và nồng độ muối bổ sung. Giai đoạn 2: hàm lượng enzyme lipase và thời gian thủy phân. - Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quá trình thu nhận hydroxyapatite có kích thước nano từ xương cá Tra gồm: phương pháp tiền xử lý nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian nung và tốc độ gia nhiệt nung. - Thử nghiệm xác định hàm lượng hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite thích hợp bổ sung vào thức ăn tôm thẻ chân trắng 20 – 55 ngày tuổi để đánh giá khả năng tăng trưởng của tôm, 2
8. tác động của môi trường nuôi tôm so với chỉ sử dụng thức ăn tôm thương mại. 4. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là phế liệu cá Tra (Pangasius hypophthalmus) được thu gom từ nguyên liệu cá Tra kích cỡ 1,2 – 1,5 kg/con trên dây chuyền chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh của Công ty chế biến Thủy sản Nam Việt, tỉnh An Giang. 5. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của luận án - Luận án đã công bố số liệu về thành phần hóa học của nguồn phế liệu cá Tra (Pangasius Hypophthalmus) tại nhà máy chế biến thủy sản Nam Việt thuộc tỉnh An Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. - Luận án đã xây dựng được quy trình thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng gồm dịch protein thủy phân, hydroxyapatite, lipít thô từ phế liệu cá Tra. Đây là cách tiếp cận mới nhằm sử dụng toàn bộ nguồn phế liệu cá Tra để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao, đồng thời hướng đến quy trình sản xuất “không-chất-thải”. - Luận án đã xác định được điều kiện thủy phân phế liệu cá Tra để thu nhận dịch protein sử dụng enzyme alcalase và lipase. - Luận án đã xác định được điều kiện thu nhận hydroxyapatite (HA) kích thước nanomet từ xương cá bằng phương pháp xử lý nhiệt. Luận án cũng đã so sánh tính chất của HA thu được từ xương cá Tra so với một số sản phầm HA thu được từ các xương cá khác. - Luận án đã đánh giá thành phần hóa học, khối lượng phân tử, thành phần axit amin và axit béo của dịch protein thủy phân thu được. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về ứng dụng của dịch protein thủy phân này. - Luận án đã bước đầu thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung 5% hỗn hợp vào thức ăn, tôm tăng trưởng 123,5% về khối lượng và 112% về chiều dài so với khi không bổ sung. Việc bổ sung hỗn hợp này không ảnh hưởng đến môi trường nước nuôi tôm. Đây là cơ sở để ứng dụng hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm. 6. Kết cấu của Luận án Luận án gồm 227 trang với 130 trang nội dung, 165 tài liệu tham khảo và 59 trang phụ lục. Nội dung luận án được trình bày trong 3 chương với 31 bảng biểu và 55 hình ảnh, đồ thị, sơ đồ, qui trình. 3
9. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Phế liệu cá Tra Ngành công nghiệp chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh tạo ra một lượng lớn đầu, xương, mỡ, nội tạng và da cá Tra. Phế liệu của cá Tra (đầu, da, xương, vây, nội tạng, máu, mỡ, thịt vụn cá) chiếm khoảng 60% so với nguyên liệu cá. Theo ước tính, nếu sản lượng cá Tra nguyên liệu đạt một triệu tấn/năm thì các doanh nghiệp phải loại bỏ hơn 600.000 tấn phế liệu. Phế liệu cá chứa nhiều thành phần có giá trị như protein, lipít, khoáng, enzyme, các chất có hoạt tính sinh học. Ngày nay, công nghệ phát triển đã mở ra nhiều hướng tận dụng nguồn phế liệu cá. Từ phế liệu cá có thể sản xuất ra nhiều sản phẩm có giá trị như bột cá, dầu cá, collagen, gelatin, sản phẩm thủy phân protein, bột canxi, chế phẩm enzyme, dầu diesel sinh học và HA. Việc tận dụng phế liệu cá để chế biến chúng thành những sản phẩm có giá trị không những góp phần hạn chế sự ô nhiễm môi trường do phế liệu gây ra mà còn nâng cao giá trị sử dụng của phế liệu, tăng hiệu quả kinh tế cho các doanh nghiệp chế biến thủy sản và đem lại lợi ích kinh tế lớn cho đất nước. 1.2. Dịch protein thủy phân Dịch protein thủy phân là sản phẩm của quá trình thủy phân protein. Thành phần chủ yếu của dịch protein thủy phân là các axit amin, các peptit với chiều dài mạch khác nhau. Ngoài ra, trong dịch protein thủy phân còn chứa một lượng nhỏ khoáng và lipít. Dịch protein thủy phân có thể thu hồi từ phế liệu cá Tra theo nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân tự nhiên, phương pháp thủy phân bằng enzyme thương mại. Để thu hồi dịch protein thủy phân từ phế liệu cá đã có nhiều tác giả sử dụng các tác nhân thủy phân là các axít, kiềm mạnh hoặc các muối của nó như: HCl, NaOH, Na6(PO3)6 hoặc cũng có thể sử dụng các axit hữu cơ để thủy phân như: axít formic, axít lactic. Sử dụng enzyme nội tại để thủy phân thịt cá thu hồi dịch protein thủy phân là một phương pháp thực hiện từ lâu đời. Quá trình sản xuất nước mắm truyền thống là một phương pháp tận dụng enzyme nội tại để thủy phân protein thịt cá thành sản phẩm cuối cùng là các axít amin trong sản phẩm nước mắm là phương pháp rất phổ biến hiện nay. Bổ sung enzyme từ bên ngoài vào để tăng tốc độ thủy phân, rút ngắn thời gian thủy phân, tăng năng suất thủy phân và đạt được mục đích công nghệ mong muốn là một phương pháp thủy phân rất hiện đại, 4
10. phổ biến và đang được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Để thủy phân cơ thịt cá cắt mạch polypeptít tạo thành sản phẩm peptít, axít amin có thể sử dụng hệ enzyme protease với các loại enzyme khác nhau tùy thuộc vào cơ chất và mục đích của quá trình thủy phân. Nhìn chung, các nghiên cứu này chỉ mới sử dụng một loại enzyme, hoặc kết hợp hỗn hơp enzyme như alcalase, flavourzyme, protamex để nghiên cứu bước đầu và tập trung để nghiên cứu tìm ra chế độ tối ưu để sản xuất dịch thủy phân ở một số loại cá, phụ phẩm có tại Việt Nam, chưa nghiên cứu ứng dụng của dịch thủy phân và phát triển thành quy mô công nghiệp, chưa đánh giá đầy đủ chất lượng dịch protein thu nhận. Do vậy, việc nghiên cứu một công nghệ đầy đủ và có hệ thống theo hướng thân thiện với môi trường cũng như tính đến hiệu quả kinh tế là điều rất cần thiết để hướng đến có thể sản xuất dịch thủy phân có độ thủy phân và hàm lượng đạm axit amin cao ứng dụng cho các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và y dược. 1.3. Hydroxyapatite (HA - Ca10(PO4)6(OH)2) 1.3.1. Tính chất của HA Canxi hydroxyapatite (hay còn được gọi là hydroxyapatite, HA) có công thức phân tử là Ca5(PO4)3(OH) hoặc Ca10(PO4)6(OH)2. Trong cơ thể người và động vật, HA là thành phần chính của xương (chiếm đến 65 – 70% khối lượng) và răng (chiếm 99%). HA được nghiên cứu rộng rãi do có các tính chất quý giá như: hoạt tính và khả năng tương thích sinh học cao với tế bào và mô, tạo liên kết trực tiếp với xương non dẫn đến sự tái sinh xương nhanh mà không bị cơ thể đào thải. Mặt khác, HA là dạng canxi photphat dễ hấp thu nhất đối với cơ thể con người với tỷ lệ Ca/P 1,67 đúng như tỷ lệ trong xương và răng người. HA có có màu trắng, trắng ngà, vàng nhạt hoặc xanh lơ, tùy theo điều kiện hình thành, kích thước hạt và cấu trúc phân tử. Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể 2+ 3- - HA gồm các ion Ca , PO4 và OH . 1.3.2. Ứng dụng của hydroxyapatite Trong nhiều thập kỷ qua, việc nghiên cứu tổng hợp HA đã được các nhà khoa học vật liệu quan tâm do tính tương thích sinh học tuyệt vời với tế bào động vật, tương tác tốt với các polyme sinh học và có khả năng tương thích với xương tốt. HA đã được chứng minh là có thể thúc đẩy sự phát triển của xương mới mà không gây ra độc tính cục bộ hoặc toàn thân, viêm hoặc dị ứng. Khi cấy ghép vật liệu gốm chứa HA vào cơ thể, một lớp mô mới được hình thành trên bề mặt và góp phần vào sự 5
11. liên kết của các mô cấy vào xương, dẫn đến định hình vượt trội mô cấy đến các mô xung quanh. Hơn nữa, một số nghiên cứu cho thấy HA có thể được sử dụng như một hợp chất mô hình để nghiên cứu quá trình khoáng hóa sinh học trong cơ thể con người. Hiện nay, HA đang được nghiên cứu là vật liệu cho các ứng dụng y sinh học khác nhau như: thay thế cho xương và các khuyết tật của răng, răng giả, cấy ghép xương, kỹ thuật mô, tác nhân truyền dẫn thuốc, tác nhân điều trị bệnh loãng xương, vật liệu nha khoa và lớp phủ hoạt tính sinh học lên miếng cấy ghép xương bằng kim loại. Ngoài lĩnh vực dược học và y sinh học, vật liệu xử lý nước ô nhiễm kim loại nặng, thuốc nhuộm. 1.3.3. Phương pháp điều chế HA Đã có rất nhiều phương pháp tổng hợp HA được phát triển. Nhìn chung, có thể phân loại thành 2 nhóm phương pháp: (i) phương pháp 2+ 3- tổng hợp bằng hóa học từ các muối vô cơ có chứa ion Ca và PO4 , (ii) phương pháp thu nhận từ các nguồn tự nhiên. Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu thu nhận HA từ các nguồn tự nhiên đặc biệt là từ xương cá đã được công bố. Trong hầu hết các nghiên cứu này, phế liệu cá sau khi đưa về phòng thí nghiệm được đun sôi loại bỏ tạp chất, phần thịt thừa, lipít sau đó đem sấy khô sẽ thu được xương cá thô. Trong công đoạn tiếp theo, phương pháp chính được sử dụng đó là nung xương cá thô ở nhiệt độ cao khoảng 600 - 1200oC để thu nhận HA. 1.4. Thức ăn cho tôm hậu ấu trùng Thức ăn viên cho tôm được nhập khẩu vào VN từ năm 1993 và được sử dụng rộng rãi từ năm 1996, đến nay nhu cầu sử dụng hàng năm vào khoảng 200.000 - 250.000 tấn. Trong đó, hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một số lượng lớn bột cá để sản xuất thức ăn cho nuôi trồng thủy sản, trong đó nhu cầu thức ăn cho tôm rất lớn. Tôm thẻ chân trắng là loại ăn tạp nhưng chúng rất thích thức ăn có nguồn gốc từ động vật. Hiện nay có ba loại thức ăn chính dành cho tôm thẻ chân trắng: Thức ăn công nghiệp, thức ăn tự nhiên và thức ăn tự chế. Tôm thẻ chân trắng khi mới thả ăn hoàn toàn bằng thức ăn công nghiệp, đảm bảo lượng dinh dưỡng, môi trường nước ao nuôi. Ngoài ra, cần bổ sung khoáng, men, vitamin C, E, dầu mực. Thành phần dinh dưỡng và bổ sung dinh dưỡng vào thức ăn tôm bao gồm: protein, lipít, khoáng, carbonhydrat, vitamin 6
12. Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Phế liệu cá Tra Phế liệu cá Tra (Pangasius hypophthalmus) được thu gom từ nguyên liệu cá Tra kích cỡ 1,2 – 1,5 kg/con trên dây chuyền chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh của Công ty Chế biến Thủy sản Nam Việt, tỉnh An Giang. Phế liệu cá tươi (đầu cá, nội tạng, vây, xương, da, đuôi) được bao gói trong túi PE và ướp đá lạnh trong thùng xốp, vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu được xay nhỏ bằng máy xay trục vít, kích thước lỗ sàn 1cm, trộn đều và đồng nhất mẫu. Cân mỗi mẫu 100g cho vào túi PE, buộc kín miệng túi và cấp đông ở nhiệt độ - 18oC, trước khi sử dụng cho quá trình thí nghiệm. 2.1.2. Enzyme Alcalase được mua của Công ty Novozyme (Đan Mạch), chi nhánh Việt Nam. Alcalase là một endopeptidase có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis có hoạt lực là 2,4 AU (Anson Units)/g, điều kiện hoạt động thích hợp là 55 – 70oC, pH 6,5 – 8,5. Lipase được mua của Hãng Sigma-Aldrich (Đức). Enzyme này được tách chiết từ tụy lợn, có hoạt lực là 100 – 400 IU/mg protein, điều kiện hoạt động thích hợp là 55 – 60oC, pH 3,8 – 5,5. Lipase là xúc tác đặc hiệu cắt liên kết ester giữa các acid béo và glycerol của cơ chất triacylglycerol. 2.1.3. Tôm thẻ chân trắng Tôm thẻ chân trắng (12 ngày tuổi, post 12) được mua chọn lọc tại Công ty Giống Thủy sản – Ninh Hòa, Khánh Hòa, tôm được kiểm tra sạch bệnh đốm trắng, bệnh EMS/AHPND, bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô. Tôm thẻ chân trắng post 12 được nuôi chăm sóc tại Trung tâm nghiên cứu giống và dịch bệnh, Trường Đại học Nha Trang trong 8 ngày đạt chiều dài 39,45 ± 0,42 mm, khối lượng 0,29 ± 0,02g. Tôm có màu sắc tươi sáng, vỏ mỏng, đầu thân cân đối và đuôi xòe ra. Tất cả tôm linh hoạt, khỏe mạnh, phân bổ đều trong bể nuôi, ruột tôm chứa đầy thức ăn. 2.1.4. Hóa chất dùng trong nghiên cứu Tất cả hóa chất dùng nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích. Các loại hóa chất đều được bảo quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất ghi trên bao bì trước khi sử dụng. 7
13. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Sơ đồ phương pháp tiếp cận các vấn đề nghiên cứu được trình bày ở Hình 2.1 - Nghiên cứu xử lý nguyên liệu: Để làm cơ sở cho việc lựa chọn phương pháp thủy phân, phế liệu cá Tra (đầu, khung xương, nội tạng, da, vây ) được phân tích về thành phần khối lượng và thành phần hóa học. Dựa trên kết quả phân tích, nghiên cứu quá trình xử lý phế liệu cá có tách lipít và không tách lipít. Các phương pháp xử lý gồm: (i) nấu chín và ép, (ii) không tách lipít. - Nghiên cứu quy trình sản xuất dịch protein thủy phân từ phế liệu cá Tra bằng enzyme alcalase. Để xác định điều kiện thủy phân thích hợp nhất, khảo sát ảnh hưởng của các thông số: kích cỡ nguyên liệu, hàm lượng enzyme, nhiệt độ, thời gian, nồng độ muối NaCl bổ sung. Sau quá trình thủy phân kết thúc, hỗn hợp được lọc tách thành hai phần gồm: (i) phần rắn chứa chủ yếu là xương cá được sử dụng làm nguyên liệu để nghiên cứu thu nhận HA sau này; (ii) phần lỏng gồm protein hòa tan, protein không hòa tan (dạng sệt) và lipít thô. - Nghiên cứu giảm hàm lượng lipít có trong dịch protein thủy phân từ phế liệu cá Tra bằng enzyme lipase: Sử dụng lipase để tiếp tục thủy phân phần dịch lỏng thu được từ phế liệu cá Tra bằng alcalase để thu nhân dịch protein thủy phân có hàm lượng lipít thấp nhằm sử dụng làm nguồn bổ sung vào thức ăn tôm thẻ giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. Ở giai đoạn này nghiên cứu các thông số gồm: hàm lượng lipase và thời gian thủy phân. Các yếu tố: nhiệt độ, pH tham chiếu theo hướng dẫn nhà sản xuất enzyme. - Nghiên cứu quy trình sản xuất hydroxyapatite kích thước nano từ phần xương cá thô: tiền xử lý phế liệu để thu nhận xương cá Tra thô. Phần xương cá thô thu nhận sau quá trình thủy phân phế liệu cá Tra bằng alcalase được rửa 3 lần bằng nước sạch, sấy khô đến khối lượng không đổi. Sau đó, tiến hành nung ở các chế độ nhiệt độ, thời gian, tốc độ gia nhiệt khác nhau để thu nhận hydroxyapatite kích thước nanomet. - Nghiên cứu bước đầu thử nghiệm: ứng dụng bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite kích thước nanomet thu nhận từ phế liệu cá Tra vào thức ăn tôm thẻ chân trắng giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. Các cơ sở khoa học và thiết kế thí nghiệm chi tiết được trình bày trong. Phương pháp tiếp cận này hướng đến thu nhận tối đa các hợp chất có giá trị từ nguồn phế liệu cá Tra. Đồng thời sử dụng tác nhân enzyme 8
14. có đặc tính an toàn, thân thiện với môi trường. Tuy nhiên, phạm vi của đề tài không tập trung nghiên cứu sâu về tinh chế sản phẩm lipít và protein không tan mà chỉ dừng lại ở bước thu nhận hai sản phẩm này ở dạng thô. Hình 2.1. Sơ đồ phƣơng pháp tiếp cận các vấn đề nghiên cứu của Luận án. 9
15. 2.3. Phƣơng pháp phân tích, đánh giá nguyên liệu và sản phẩm 2.3.1.Phân tích thành phần hóa học cơ bản của phế liệu Phế liệu cá Tra được xác định hàm lượng protein thô được xác định bằng phương pháp Kjeldahl. Hàm lượng tro và ẩm được xác định theo phương pháp chuẩn của AOAC. Hàm lượng lipít thô được phân tích bằng phương pháp Folch. 2.3.2. Phân tích tính chất sản phẩm thu được Dịch protein thủy phân và lipít thô: Xác định DH theo phương pháp DNFB. Xác định hiệu suất thu hồi nitơ (NR) được xác định theo công thức sau: NR(%)=(Lượng nitơ tổng số có trong dịch thủy phân thu được từ 100g phụ phẩm cá Tra (g))/(Lượng nitơ tổng số có trong 100 g phụ phẩm cá Tra đem thủy phân (g))×100. Xác định thành phần và hàm lượng đạm axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp sắc ký gell thấm qua (GPC). Hydroxyapatite: Phân tích hàm lượng kim loại bằng phương pháp Hệ thống khối phổ plasma ghép cặp cảm ứng ICP-MS. Phân tích hàm lượng oxit kim loại bằng phương pháp XRF. Xác định thành phần nguyên tố của HA bằng phổ XPS . Xác định diện tích bề mặt của HA bằng phương pháp Brunauer–Emmett–Teller (BET). Các thông tin về cấu trúc hóa học được xác định bằng phổ FTIR (Nicolet iS10, Thermo Scientific) với số sóng 500–4000 cm−1. Độ rắn cấu trúc hydroxyapatite được xác định bằng XRD (PANalytical, X'Pert-PRO MPD). Cấu trúc bề mặt, hình dạng và kích thước của hydroxyapatite được kiểm Tra bằng kính hiển vi điện tử SEM (Hitachi, S-4200). 2.3.3. Phân tích trong quá trình thử nghiệm nuôi tôm Các chỉ tiêu môi trƣờng theo dõi gồm: Nhiệt độ và pH được đo 2 lần/ngày vào lúc 7:00 giờ sáng và 15:00 giờ chiều bằng nhiệt kế và máy đo pH (HI98127 – Hanna, Mỹ) đã được kiểm tra độ chính xác; độ kiềm, nitrite, DO được đo 3 ngày/lần. Độ kiềm được phân tích theo phương pháp chuẩn độ acid, DO được phân tích theo phương pháp Indophenol Blue. Nitrite được xác định bằng bộ test SERA. Các chỉ tiêu vi sinh: Thu mẫu, phân tích vi khuẩn tổng số và vi khuẩn vibrio 1 tuần/lần trong nước. Mật độ vi khuẩn tổng được xác định bằng phương pháp pha loãng và đếm trên đĩa thạch Nutrient agar có bổ sung 1,5% NaCl (NA). Tương tự, mật độ vibrio tổng số được xác định bằng phương pháp pha loãng và đếm trên đĩa thạch TCBS (Thiosulfat Citrate Bile Salt Surcose). Cụ thể, mẫu nước ban đầu (nồng độ 100) 10
16. được pha loãng với nước muối 0,85% ra 3 nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3. Sau đó, hút 100 µl từ mỗi nồng độ pha loãng của mẫu nước cho vào đĩa môi trường NA hoặc TCBS, dùng que thủy tinh trãi đều, mỗi nồng độ lặp lại 2 lần. Ủ đĩa môi trường ở 280C trong 24 giờ và xác định kết quả với công thức: Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) = Số khuẩn lạc x độ pha loãng x 10. Các chỉ tiêu theo dõi tôm: Thu ngẫu nhiên 20 mẫu tôm, đo chiều dài tổng ở các giai đoạn 12 ngày tuổi bằng kính hiển vi có trắc vi thị kính. Đối với tôm các giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi đo chiều dài tổng và khối lượng thân tôm bằng thước đo có thang đo 0,1mm và cân tiểu li với độ chính xác 1 mg. Tỷ lệ sống được xác định khi tôm đạt giai đoạn 55 ngày tuổi. Tỷ lệ sống (%) = Tổng số tôm thu hoạch (con) x 100 / tổng số tôm thả ban đầu (con). Năng suất tôm thu hoạch được xác định là trọng lượng tôm thu hoạch trung bình của các bể thí nghiệm. Ngoài ra để đánh giá chất lượng vỏ tôm thẻ 55 ngày tuổi, tiến hành thực hiện 2 chỉ tiêu đánh giá về hình dạng và độ rắn cấu trúc của vỏ tôm được xác định bằng kính hiển vi điện tử quét SEM và phổ nhiễu xạ tia X. 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm SPSS phân tích ANOVA kết hợp với Duncan test, t-test để so sánh giá trị trung bình của các mẫu nghiên cứu. Vẽ đồ thị bằng phần mềm Origin 10.2. Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu báo cáo là giá trị trung bình của 3 lần phân tích, giá trị p < 0,05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê. 11
17. Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu những tính chất của phế liệu cá Tra Kết quả phân tích được trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần khối lƣợng và hóa học của phế liệu cá Tra Thông số Hàm lƣợng (%) Thành phần khối lượng Đầu 45,25 ± 0,45 Nội tạng 21,30 ± 0,23 Xương 28,95 ± 0,28 Vây, đuôi 4,5 ± 0,15 Thành phần hóa học Hàm lượng theo Hàm lượng theo nguyên liệu chất khô Protein 14,66 ± 0,75 42,62± 0,75 Lipít 14,60 ± 0,63 41,85± 0,63 Nước 65,11 ± 0,68 - Khoáng 5,63 ± 0,15 15,53 ± 0,15 Theo Bảng 3.1, thành phần khối lượng phế liệu cá Tra chứa chủ yếu là đầu (45,25%) và xương (28,95%), phần còn lại là nội tạng (21,30%) và một lượng nhỏ vây, đuôi (4,5%). Về thành phần hóa học, phế liệu cá Tra có 3 phần chính bao gồm protein (42,62%), lipít (41,85%) và khoáng (15,53%). Tất cả các thành phần trên đều có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm có giá trị gia tăng. Tuy nhiên, hàm lượng lipít cao (41,85%) nên có thể ảnh hưởng đến việc lựa chọn phương pháp, các thông số và tác nhân trong quá trình thủy phân thu nhận FPH, HA và thu hồi lipít. 3.2. Kết quả nghiên cứu tách lipít từ phế liệu cá Tra Kết quả nghiên cứu phương pháp tiền xử lý phế liệu cá Tra thích hợp để tách lipít trước khi thủy phân được trình bày trong Bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp tách lipít Hàm lƣợng Hàm lƣợng lipít và protein Phƣơng pháp lipít đƣợc còn lại, theo nguyên liệu (%) tách ra (%) Lipít Protein Nấu chín – ép 61,92 ± 0,85 5,56 ± 0,48 10,48 ± 0,53 Không tách lipít 0 14,60 ± 0,63 14,66 ± 0,75 Từ Bảng 3.2 thấy rằng, khi xử lý nguyên liệu theo phương pháp Nấu chín – ép, hàm lượng lipít được tách ra khỏi nguyên liệu là 12
18. 61,92%. Khi xử lý nguyên liệu theo phương pháp Nấu chín – ép, hàm lượng lipít còn lại trong nguyên liệu (5,56%), hàm lượng protein còn lại trong nguyên liệu là 10,48% sẽ ảnh hưởng rất lớn hiệu suất thu hồi đạm trong quá trình thủy phân. 3.3. Nghiên cứu những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân protein trong phế liệu cá Tra bằng enzyme alcalase 3.3.1. Ảnh hƣởng của kích cỡ nguyên liệu Dựa theo kích cỡ của nguyên liệu cá Tra sử dụng cho chế biến phân phế liệu ra 6 loại mẫu khác nhau (Bảng 3.3). Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của kích cỡ nguyên liệu cá Tra đến DH và NR của dịch FPH Hàm Hàm Kích cỡ lƣợng lƣợng nguyên liệu DH (%) NR (%) nƣớc protein (g/con) (%) (%) 500 – 700 68,30 ± 13,60 ± 37,85a ± 0,98 81,55a ± 1,12 0,85 0,60 700 – 900 68,10 ± 13,68 ± 35,63b ± 1,05 80,78 ± 0,85 0,75 0,55 ab 900 – 1100 67,40 ± 14,25 ± 33,75c ± 0,95 80,42ab ± 1,02 0,70 0,72 1100 – 1500 66,50 ± 14,70 ± 31,92d ± 1,08 79,38cb ± 1,05 0,75 0,80 1500 – 2000 65,30 ± 14,20 ± 28,98e ± 1,13 78,45db ± 1,25 0,58 0,65 Cỡ xô (không 65,50 ± 14,50 ± 31,33d ± 0,87 79,22cb ± 1,05 phân chia 0,65 0,85 mẫu) Khi điều kiện thủy phân: hàm lượng alcalase 0,6%, nhiệt độ 500C, pH tự nhiên, tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1, nồng độ muối 1,5%, thời gian thủy phân 4 giờ thì nguyên liệu có kích cỡ nhỏ (500 – 700 g/con) ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất thu hồi nitơ và độ thủy phân nhưng khi kích cỡ nguyên liệu tăng lên thì hiệu suất thu hồi nitơ và độ thủy phân đều giảm. Điều này được giải thích, khi kích cỡ nguyên liệu cá càng lớn thì hàm lượng lipít càng cao, phế liệu thu nhận có hàm lượng lipít cao kìm hãm quá trình thủy phân, tốc độ thủy phân chậm. 13
19. 3.3.2. Ảnh hƣởng hàm lƣợng enzyme alcalase đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra Ở cùng điều kiện thủy phân 3 giờ, nhiệt độ 50ºC, pH thủy phân tự nhiên, DH và NR tăng lên khi hàm lượng enzyme tăng từ 0,1 đến 0,6% so với khối lượng nguyên liệu. Khi không có enzyme bên ngoài thêm vào (nghĩa là quá trình tự thủy phân diễn ra), DH đạt giá trị 6.48% sau 3 giờ thủy phân. Giá trị DH này sẽ tăng có ý nghĩa đến 20,58% khi enzyme alcalase thương mại được thêm vào quá trình thủy phân với hàm lượng là 0,1%. Trong quá trình tự thủy phân, quá trình thủy phân xảy ra chậm là do phụ thuộc lớn của nhiệt độ và enzyme nội tại trong bản thân nguyên liệu. DH tiếp tục tăng lên chậm từ 23,98% đến 30,69% trong khoảng hàm lượng enzyme từ 0,2 – 0,4% và đạt đến giá trị cao nhất là 30,69% ở hàm lượng enzyme là 0,4%. Sau đó, DH gần như không thay đổi hoặc giảm rất ít với nồng độ enzyme sử dụng cho quá trình thủy phân lớn hơn 0,4%. Hình 3.1. Ảnh hƣởng của (a) hàm lƣợng alcalase, (b) nhiệt độ, (c) thời gian, (d) nồng độ muối bổ sung đến DH và NR của dịch FPH. Quan sát ở Hình 3.1a, giá trị NR tăng lên có ý nghĩa khi hàm lượng enzyme tăng từ 0,1% đến 0,6%. Đáng chú ý, giá trị NR tăng nhanh chóng từ 37,22% đến 78,98% trong khoảng hàm lượng enzyme 0,1% đến 0,2%. Khi hàm lượng enzyme tăng từ 0,3% đến 14