Luận văn Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản

1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Văn Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10-HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2019
2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VĂN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG 10- HDA TRONG SẢN PHẨM SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440112.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. DƯƠNG HỒNG ANH Hà Nội, 2019
3. LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân thành cảm ơn PGS.TS. Dương Hồng Anh đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin trân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu Môi trường và Phát triển Bền vững – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện và cung cấp các trang thiết bị nghiên cứu, đặc biệt là các anh chị, các bạn trong nhóm Điện di mao quản đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài, luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài QG.18.05 của Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Hóa học nói chung và Bộ môn Hóa Phân tích nói riêng đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên Bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Văn Thị Thanh Huyền
4. MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 1.1. SỮA ONG CHÚA 3 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm của sữa ong chúa 3 1.1.2.Thành phần hóa học của sữa ong chúa 4 1.1.3.Thu hoạch sữa ong chúa 7 a. Quy trình bắt cóc ong chúa 7 b.Quy trình giả làm tổ ong chúa 7 1.1.4.Tác dụng của sữa ong chúa 8 1.2.Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic (10-HDA) 9 1.2.1.Một số nghiên cứu về 10-HDA 11 a.Hoạt tính sinh học 11 b.Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa 13 c.So sánh phương pháp và đề xuất phương pháp thích hợp 17 1.3.Giới thiệu về phương pháp điện di mao quản 18 1.3.1.Dòng điện di thẩm thấu (EOF) 20 1.3.2.Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 21 1.3.3.Kỹ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 22 1.3.4.Các thông số đánh giá trong phương pháp điện di mao quản 23 1.3.5.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tách chất trong điện di mao quản 24 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 26 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 26 2.2. Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên CE 26 2.2.2. Khảo sát quy trình xử lí mẫu 27 2.3 Đánh giá phương pháp 28 2.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 30
5. 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 30 2.3.2. Hóa Chất 31 2.4 Thông tin mẫu thực 32 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1.Khảo sát điều kiện tối ưu nhằm phân tích hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa bằng phương pháp CE-C4D 35 3.1.1. Khảo sát thành phần và pH của dung dịch đệm điện li 35 3.1.2. Khảo sát nồng độ và pH của dung dịch đệm điện li 37 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu 39 3.1.4. Khảo sát điện thế tách 41 3.2. Khảo sát và tối ưu quy trình xử lí mẫu 42 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến diện tích píc của 10- HDA 42 3.2.2. Khảo sát dung môi hòa tan 45 3.2.3. Khảo sát tỉ lệ thành phần dung môi hòa tan 47 3.3. Đánh giá phương pháp phân tích 49 3.3.1. Xây dựng đường chuẩn, xác định hệ số tương quan 49 3.3.2. Đánh giá độ chụm 51 3.3.3. Độ đúng (độ thu hồi) 52 3.3.4. So sánh với phương pháp tiêu chuẩn HPLC 54 3.3.5. Phân tích mẫu thực tế 55 KẾT LUẬN 57 PHỤ LỤC
6. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ 4 Bảng 1.2. Thành phần của sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô 6 Bảng 1.3. Đề suất hàm lượng của một số quốc gia và tổ chức 10,11 Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu được nghiên cứu 33,34 Bảng 3.1. Điều kiện thiết bị điện di mao quản 42 Bảng 3.2. Khảo sát diện tích pic trung bình của 10-HDA với các tỉ lệ dung môi khác nhau 48 Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ 10-HDA 50 Bảng 3.4. Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường 51 Bảng 3.5. Các thông số đánh giá phương pháp 52 Bảng 3.6. Giá trị độ lệch chuẩn 53 Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi của 10-HDA 54 Bảng 3.8. Kết quả so sánh giữa CE-C4D và HPLC với số mẫu thực tế 55
7. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sự phát triển của ấu trùng bên trong sữa ong chúa 4 Hình 1.2: Sữa ong chúa 4 Hình 1.3: Công thức hóa học của 10-hydroxyl-trans-2-decenoic acid (10-HDA) 9 Hình 1.4: Sơ đồ của một hệ điện di mao quản đơn giản 19 Hình 1.5: Hệ điện di mao quản 1 kênh 19 Hình 1.6: Bộ ghi tín hiệu 19 Hình 1.7: Lớp điện kép và tốc độ di chuyển của các ion trong 21 Hình 1.8: Cấu tạo detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (C4D) 22 Hình 1.9: Các kĩ thuật bơm mẫu trong điện di mao quản 23 Hình 3.1: Điện di đồ của lựa chọn thành phần đệm (tại pH 9) phân tích 10-HDA (20 mg/L) 36 Hình 3.2. Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 20 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 37 Hình 3.3. Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 50 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 38 Hình 3.4. Điện di đồ 10-HDA (20 mg/L) với đệm 100 mM Tris/Ace pH 8 ÷ 9 38 Hình 3.5. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới tín hiệu của 10- HDA 40 Hình 3.6. Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của thế tách tới tín hiệu 10-HDA 41 Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của giấy lọc và quy trình ly tâm đến việc phân tích 10-HDA (mẫu 1) 43 Hình 3.8. Điện di đồ phân tích 10-HDA với ly tâm 1500 rpm trong 15 phút, lọc bằng PTFE, nilon và xenlulozo axetat 44 Hình 3.9. Điện di đồ phân tích 10-HDA với không ly tâm, lọc bằng PTFE, nilon và xenlulozo axetat 44 Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện diện tích pic trung bình của 10-HDA với các dung môi hòa tan 46 Hình 3.11. Điện di đồ phân tích 10-HDA với các dung môi chiết khác nhau (mẫu 1) 46
8. Hình 3.12. Điện di đồ phân tích 10-HAD với các tỉ lệ dung môi chiết khác nhau (mẫu 4) 48 Hình 3.13. Đường chuẩn 10-HDA 50 Hình 3.14. Điện di đồ phân tích 10-HDA trong mẫu chuẩn, mẫu thực và mẫu thêm chuẩn 53 Hình 3.15. Điện di đồ phân tích 10-HDA trong một số mẫu sản phẩm sữa ong chúa; mẫu 1: sữa ong chúa tươi, mẫu 3: sữa ong chúa/ấu trùng đông khô dạng bột, mẫu 4 và 5: sữa ong chúa đông khô dạng gel , mẫu 7: mật ong sữa chúa 55
9. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ 10-HAD Axit 10-Hydroxy-2-decenoic C4D Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện CE Phương pháp điện di mao quản CHES Axit N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic CZE Điện di mao quản vùng EOF Dòng điện di thẩm thấu GC-MS Sắc kí khí – detector khối phổ HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao IDL Giới hạn phát hiện của thiết bị IFE Điện di mao quản điểm đẳng điện IQL Giới hạn định lượng của thiết bị ITP Điện di mao quản gel Leff Chiều dài hiệu dụng của mao quản Ltot Tổng chiều dài mao quản MDL Giới hạn phát hiện của phương pháp MQL Giới hạn định lượng của phương pháp MECC Điện di mao quản kiểu mixcelle MES Axít 2-(N-morpholino) ethanesulfonic MOPS Axít 3-(N-morpholino) propanesulfonic RJ Sữa ong chúa Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane UV – Vis Quang phổ hấp thụ phân tử %RSD % độ lệch chuẩn tương đối %SD % độ lệch chuẩn
10. MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, các ngành sản xuất thực phẩm chức năng và sản phẩm làm đẹp ngày càng phát triển trên toàn thế giới đặc biệt là ở Việt Nam giúp duy trì sức khỏe, cải thiện nét đẹp của con người. Các sản phẩm làm đẹp và dinh dưỡng hiện nay tập trung chủ yếu vào những sản phẩm tự nhiên có sẵn như sữa ong chúa, đông trùng hạ thảo, sâm . Trong dân gian, Sữa ong chúa (RJ) đã được biết đến với nhiều tác dụng như cải thiện trí nhớ, tăng năng lượng, giảm lo lắng hoặc căng thẳng, kháng viêm, chống ung thư, và đặc biệt có khả năng chống oxi hóa, ngăn ngừa lão hóa Nhiều năm trở lại đây, sữa ong chúa đã được sử dụng trong các chế độ ăn kiêng, làm đẹp và trở thành sản phẩm thương mại được ưa dùng. Với thành phần hóa học đa dạng phong phú, giàu protein, chứa nhiều axit amin thiết yếu, các axit béo cần thiết như axit pantothenic (B-5) và pyridoxin (B-6) sữa ong chúa có nhiều tác dụng tốt với con người ở mọi lứa tuổi. Trong tất cả các sản phẩm làm từ ong như phấn hoa, keo ong, mật ong, thì điểm khác biệt giữa sữa ong chúa và những sản phẩm khác là chỉ trong sữa ong chúa có thành phần axit 10-Hydroxy-2-decenoic (10-HDA). Do đó sự hiện diện của 10- HDA có thể được sử dụng làm dấu chuẩn (“marker”) để phân biệt sữa ong chúa với các sản phẩm khác. Và hàm lượng của 10-HDA có thể được sử dụng như một thông số cho chất lượng sữa ong chúa. Theo quy định của Bộ Nông nghiệp (MOA) Trung Quốc, hàm lượng 10-HDA không được thấp hơn 1,4% đối với sữa ong chúa nguyên chất dạng kem và 4,2% đối với dạng đông khô. Đã có nhiều nghiên cứu khẳng định tác dụng chống và ngăn ung thư, kháng viêm và chống oxi hóa, của 10-HDA [9]. Với những tác dụng của sữa ong chúa và đặc biệt là 10-HDA đã dẫn đến sự nhập khẩu số lượng lớn sữa ong chúa mỗi năm ở nhiều quốc gia. Nhu cầu sử dụng tăng cao dẫn đến sự xuất hiện của các mặt hàng giả, hàng kém chất lượng. Vì vậy, các nghiên cứu về thành phần của sữa ong chúa được sản xuất, đánh giá chất lượng của các sản phẩm thương mại là rất cần thiết. 1
11. Việc phân tích 10-HDA ở Việt Nam hiện này vẫn là vấn đề mới, chưa có tiêu chuẩn quy định cho sản phẩm cũng như quy trình tiêu chuẩn theo QCVN. 10-HDA được phân tích định tính, định lượng chủ yếu bằng phương pháp sắc ký (như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC-MS), ). Các phương pháp này đều có độ nhạy, độ chính xác cao, nhưng phải sử dụng thiết bị có chi phí đầu tư lớn và sử dụng nhiều dung môi hữu cơ. Việc xây dựng một phương pháp phân tích nhanh, thuận tiện, dễ áp dụng và kinh tế để xác định 10-HDA là nhu cầu cần thiết trong điều kiện Việt Nam, một trong số các lựa chọn đó là phương pháp điện di mao quản. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) gần đây được biết đến là một công cụ hữu hiệu trong phân tích thực phẩm với các ưu điểm nổi trội như thiết bị nhỏ gọn có thể chế tạo và linh kiện thay thế sẵn có tại Việt Nam, hoạt động đơn giản, lượng mẫu và dung môi hóa chất ít, chi phí đầu tư và vận hành thấp, từ đó cho chi phí phân tích mẫu thấp hơn so với các phương pháp phân tích sắc ký. Với đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp điện di mao quản”, bản luận văn này tập trung vào các mục tiêu nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE - C4D) nhằm xác định 10-HDA trong một số sản phẩm sữa ong chúa. 2
12. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. SỮA ONG CHÚA 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm của sữa ong chúa Sữa ong chúa là thức ăn duy nhất của ong chúa và các ấu trùng ong, được sản sinh từ tuyến tiết niệu và tuyến sau tại vùng hàm dưới của ong thợ trên 7 ngày tuổi [17]. Ong thợ chọn một vài ấu trùng nhỏ để phát triển thành ong chúa và cho chúng ăn một lượng lớn sữa ong chúa, kiểu cho ăn này kích hoạt sự phát triển về kích thước, khả năng sinh sản và tuổi thọ. Ong chúa dùng loại thức ăn này cả cuộc đời, còn những ấu trùng ong được dùng trong 3 ngày đầu tiên của cuộc đời đến ngày thứ tư thì được chuyển qua ăn mật ong và phấn ong, lớn lên thành ong thợ, điều này gây ra sự khác biệt giữa ong chúa và ong thợ. Ong chúa là con ong cái duy nhất có quyền đẻ trứng trong đàn ong, dài và to hơn các ong đực, ong thợ (là ong cái mất khả năng sinh sản và có khả năng làm ra mật), cánh ngắn hơn thân, có nhiệm vụ đẻ trứng nhưng không làm ra mật. Tuổi thọ của ong chúa khoảng 5 - 6 năm, gấp 40 lần so với ong thợ là chỉ sống được từ 30 - 40 ngày tuổi. Vào thời gian sinh sản, ong chúa có thể đẻ lên đến 2000 quả trứng trong một ngày (lớn hơn cả trọng lượng cơ thể của nó). Kích thước cơ thể của ong chúa lớn gấp rưỡi ong thợ, không có giỏ phấn hóa trên chân sau của mình và không có tuyến giáp như ong thợ. Mỗi tổ chỉ có một con ong chúa, nếu trong tổ có nhiều ong sẽ tách thành tổ mới, thường vào mùa xuân. Ong chúa sinh sản tốt nhất là đầu năm. Nếu mất ong chúa, các ong thợ có thể tạo chúa mới [3, 13, 25]. Ong là côn trùng, không có tuyến vú nên không tiết sữa. Sở dĩ gọi là “sữa” vì loại thức ăn đặc biệt này ở nhiệt độ thường sánh như bơ, khi nằm trong nụ chúa, nó có màu trắng ngà giống sữa, và nó dùng để nuôi các ấu trùng ong non. 3
13. Hình 1.1. Sự phát triển của ấu trùng Hình 1.2. Sữa ong chúa bên trong sữa ong chúa Quy trình phát triển của ong chúa và ong thợ được trình bày ở bảng 1.1. Bảng 1.1. Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ Trứng Ấu trùng Nhộng Con ong Tuổi thọ Ong Ngày Ngày 1-3 Ngày 4-9 Ngày 16 5-6 năm chúa 10-15 Ngày 30-40 Ong thợ Ngày 1-3 Ngày 4-9 Ngày 21 10-20 ngày 1.1.2. Thành phần hóa học của sữa ong chúa Sữa ong chúa có thành phần hóa học đa dạng và phong phú, bao gồm các thành phần chính là nước, cacbonhydrat, protein, lipit và axit béo, còn lại là các vitamin, amino axit tự do, muối khoáng . Hàm lượng của các thành phần trong sữa ong chúa được thể hiện trong bảng 1.2 [12, 27]. Hàm lượng các nhóm chất trong sữa ong chúa thay đổi phụ thuộc vào nguồn sản xuất như chất lượng đàn ong, thời tiết, môi trường nuôi; vào điều kiện bảo quản như nhiệt độ, thời gian 4
14. Nước (60%-70%): Hàm lượng nước trong sữa ong chúa khá ổn định, chiếm khoảng 60% với mọi điều kiện thu hoạch, bảo quản khác nhau và có cùng hoạt độ aw (là lượng nước có trong sữa ong chúa) là khoảng 0,92. Ở bên trong các tổ ong, sữa ong chúa liên tục được tạo ra bởi những con ong thợ cùng sự hút ẩm từ môi trường xung quanh và khả năng hòa tan của một số hợp chất. Do đó độ ẩm hay hàm lượng nước trong sữa ong chúa hầu như không thay đổi [4, 12]. Protein: Theo một số nghiên cứu, protein chiếm khoảng 27-41% là một trong những phần quan trọng nhất của sữa ong chúa khô. Các axit amin có mặt với hàm lượng phần trăm cao nhất là: prolin, lysin, axit glutamic, β-alanin, phenylalanine, aspartatin và serin [11, 12, 27]. Cacbonhydrat: Trung bình phần này chiếm 30% sữa ong chúa khô. Giống như trong mật ong, có hai loại monosaccarit chính chiếm hơn 90% tổng lượng đường là glucozo và chủ yếu là fructozo. Saccarozo thường ở nồng độ rất cao, các oligosaccarit khác như trehalozo, mantozo, gentiobiozo, isomantozo, raffinozo, erlozo, melezitozo mặc dù có nồng độ rất nhỏ nhưng chúng rất hữu ích để so sánh với mật ong và xác định được tính thật giả của sản phẩm [4, 12, 27]. Lipid và axit 10-hydroxy-2-decenoic: Thành phần này cũng xuất hiện trong sữa ong chúa cũng khá khiêm tốn, chỉ khoảng 8-19% trong thành phần sữa ong chúa khô. Nhưng không thể phủ nhận nó là thành phần quan trọng nhất của các thành phần của sữa ong chúa. Thực tế, phần lipid bao gồm chủ yếu là các axit hữu cơ (chiếm khoảng 80-90%), hầu hết là tồn tại ở dạng tự do, với cấu trúc hiếm gặp trong tự nhiên. Chúng là axit mono-, axit dihydroxy và axit dicacboxylic với 8 và 10 nguyên tử cacbon, được sắp xếp theo cách đặc trưng. Các axit hydroxy với 10 nguyên tử cacbon (như axit 10-hydroxydecenoic và 10-hydroxy-2-decenoic) có thể được tìm thấy ở nồng độ cao. Chúng không chỉ được coi là một thành phần quan trọng để so sánh sữa ong chúa và các sản phẩm khác được làm từ ong, mà còn được xác định là chất có các hoạt tính sinh học quan trọng gắn liền với chất lượng của sản phẩm sữa ong chúa [13]. 5
15. Các muối khoáng: chiếm khoảng 0,8-3% trong sữa ong chúa. Các khoáng chất này giảm dần theo thứ tự: K, Ca, Na, Mg, Zn, Fe, Cu và Mn. Các vitamin: Vitamin B-complex, vitamin B1 (thiamin), vitamin B2 (riboflavin), axit pantothenoic, biotin, niacin, axit folic, inositol, axetincolin, một lượng nhỏ vitamin C. Các vitamin tan trong chất béo: A, D, E, K thường không có hoặc nếu có thì hàm lượng cũng ít [3]. Bảng 1.2. Thành phần của sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô [4] Sữa ong chúa tươi Sữa ong chúa đông khô Nước (%) 60 - 70 1,4 > 3,5 Protein (%) 9 - 18 27 - 41 Fructozo (%) 3 - 13 - Glucozo (%) 4 - 8 - Saccarozo (%) 0,5 - 2,0 - Tạp chất (%) 0,8 – 3,0 2 - 5 pH 3,4 - 4,5 3,4 - 4,5 Độ axít (mL NaOH 3,0 – 6,0 - 0,1 N / g) Furosin (mg / 100 g < 50 - protein) 6
16. 1.1.3. Thu hoạch sữa ong chúa Sữa ong chúa là một tặng phẩm thiên nhiên mà khoa học chỉ có thể phân tích, xác định mà “không thể tái tạo”. Do đó điều mà các nhà khoa học có thể làm là nghiên cứu cặn kẽ mọi sinh hoạt của loài ong để rồi lợi dụng vào đó lấy sản phẩm phục vụ con người Trong công nghệ nuôi ong lấy mật, con người đã vô tình nhưng may mắn biết cách tạo nhiều sữa ong chúa qua chu trình tạo ong chúa giống. Ngày nay, sữa ong chúa được bán trên khắp thế giới chủ yếu là sản phẩm thu được từ công nghệ nuôi ong. Còn sữa ong chúa được lấy từ tự nhiên hầu như không được làm sản phẩm thương mại. Sau đây là trình bày sơ lược về quy trình sản xuất và thu hoạch sữa ong chúa: a. Quy trình bắt cóc ong chúa Là quy trình tạo ong chúa mới qua việc bắt đi ong chúa đang trong nhiệm kỳ. Theo đặc tính của loài ong, để cho đàn ong được tồn tại, khi các chú ong thợ thấy mất đi ong chúa, chúng lập tức chọn một trong những ấu trùng ong thúc dưỡng để trở thành ong chúa. Việc bắt cóc, biệt lập hay giết đi ong chúa đương nhiệm nhằm thúc đẩy ong thợ sớm chọn và thúc dưỡng nhiều ấu trùng ong để trở thành ong chúa. Quy trình này chỉ thích hợp dưới dạng tiểu sản xuất, lượng sữa ong chúa thu được ít. b. Quy trình giả làm tổ ong chúa Là quy trình tạo hàng loạt tổ ong chúa bằng cách lấy enzym và những mùi vị từ ong chúa đem trét vào những tổ ong mới đã chuẩn bị sẵn. Mùi vị của các tổ ong giả đã đánh lừa các chú ong thợ. Khi các chú ong thợ khám phá ra tổ ong đang bị trống, chúng liền chọn lựa những con ấu trùng ong và thúc dưỡng để trở thành những con ong chúa mới. Quy trình này hiện đại hơn so với quy trình bắt cóc ong chúa và mang nhiều tính khoa học hơn như việc lấy enzym, tạo mùi vị Nhiều nhà sản xuất với quy mô dạng xuất khẩu, họ có thể tạo hàng loạt ấu trùng ong và đặt máy hút tự động tại các tổ ong chúa lúc còn là ấu trùng ong. Sự hút sữa liên tục gây thiếu dinh 7
17. dưỡng cho ấu trùng chúa làm cho các ong thợ phải liên tục tiết ra sữa để nuôi ong chúa. Do vậy con người thu được nhiều sữa ong chúa hơn. 1.1.4. Tác dụng của sữa ong chúa Sữa ong chúa có thành phần hóa học đa dạng và phong phú nên nó có nhiều tác dụng tốt đối với cơ thể con người. Sữa ong chúa có chứa colagen, lecithin và các loại vitamin A, E tất cả đều có lợi cho da. Nếu thoa sữa ong chúa lên da hàng ngày có thể làm da trắng mịn và chống viêm da. Ngoài ra sữa ong chúa còn có nhiều hợp chất có thể làm giảm hàm lượng cholesterol. Một đánh giá cho thấy sử dụng 50 - 100 mg sữa ong chúa mỗi ngày có thể giảm 14% cholesterol và 10% triglycerit. Sử dụng sữa ong chúa thường xuyên có thể ngăn ngừa và làm chậm sự phát triển của xơ vữa động mạch. Trong một số công trình nghiên cứu khoa học đã công bố, sữa ong chúa được báo cáo như một tác nhân làm thay đổi miễn dịch, cũng được báo cáo là có tác dụng đối với hệ thần kinh đệm và các tế bào tủy sống. Ngoài ra, sữa ong chúa còn được sử dụng như một loại thực phẩm chức năng có khả năng chống lại mệt mỏi, chống dị ứng, chống lão hóa, chống vi khuẩn rất có lợi cho cơ thể. Sữa ong chúa còn làm tăng khả năng sinh dục ở cả hai giới [3] Một số nghiên cứu vào năm 2005, L.A. Salazar Olivo [23] và các cộng sự cũng đã khẳng định sữa chúa có hoạt tính sinh học đa dạng, nó có thể ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào, có khả năng chống lại sự phát triển của các tế bào ung thư của RJP30 (phần chiết protein bằng amoni sulfat 30%), ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở người, làm giảm mật độ tế bào ban đầu gấp 2,5 lần sau bảy ngày điều trị. Šimúth, J. [36] cũng đã quan sát thấy apalbumin-1 và apalbumin-2, hai protein chính trong RJ, kích thích các đại thực bào chuột giải phóng TNF-α (tế bào hoại tử khối u). Gần đây đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các chất phân hủy enzym (pepsin, trypsin và papain) và protein của RJ [32,33]. Thời gian thu hoạch và tuổi ấu trùng có nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa của RJ và RJ đã thu thập được 24 giờ sau khi chuyển ấu trùng cho thấy có tác dụng chống oxy hóa mạnh 8
18. nhất [18]. Hoạt tính chống oxy hóa của RJ cũng đã được chứng minh trong các mô hình thí nghiệm in vitro khác nhau. Năm 2007, Aziza A. El-Nekeety [5] đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm trên chuột và kết quả là RJ có tác dụng bảo vệ chống lại độc tính của Fumonisins (chất được sinh ra từ nấm, là chất độc hại cho con người và động vật). Năm 2008, Polona Jamnik [30] đã nghiên cứu trên các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae như một sinh vật mẫu, cho thấy rằng RJ làm giảm quá trình oxi hóa nội bào. Và khả năng chống lại tổn thương gan do paracetamol gây ra và tác dụng đối với độc tính sinh tinh của cisplatin đã được xác nhận trong các thí nghiệm trên các động vật thí nghiệm [7, 28, 37]. Hoạt động giống như insulin: có tác dụng chống lại bệnh tiểu đường, RJ có thể làm giảm lượng đường trong máu thông qua các peptit. Và giữ cho lượng đường trong máu ở trạng thái bình thường bằng cách tham gia vào quá trình oxy hóa glucozo để thu được năng lượng [6, 7]. Các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã nghiên cứu tác dụng của một số peptit thu được thông qua quá trình thủy phân enzym của RJ đối với chuột bị huyết áp cao. Các peptit đã ức chế enzym chuyển đổi angiotensin 1 (ACE) và áp lực sanguine đã giảm sau khi uống RJ. Hiệu quả chống tăng huyết áp đã lên tới 38% [7]. 1.2. Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic (10-HDA) Tên IUPAC: Axit trans-10-hydroxy-2-decanoic hoặc axit (E) -10-hydroxydec- 2-enoic (10-HDA) là axit béo dồi dào nhất (FA – fatty acid) và là thành phần lipid chính của sữa ong. Hình 1.3. Công thức hóa học của axit 10-hydroxy-trans-2-decenoic 9
19. Một số tiêu chuẩn của hàm lượng 10-HDA trong sữa ong chúa của một số nước Mặc dù sữa ong chúa là một sản phẩm đầy hứa hẹn với giá trị tài chính ngày càng tăng cho người nuôi ong và ngành công nghiệp nhưng phát triển thị trường lại khá chậm. Điều mà phần lớn những người nuôi ong không khuyến khích mở rộng kinh doanh là thiếu các tiêu chí chất lượng, kiểm soát tính xác thực và nguồn gốc địa lý. Ngày nay, không có tiêu chuẩn nào ở cấp độ châu Âu hoặc quốc tế cho các sản phẩm của ong, chỉ có một số quốc gia đã thiết lập các tiêu chuẩn. Quốc gia đầu tiên đặt tiêu chuẩn cho RJ là Argentina năm 1979, tiếp theo là Bungari năm 1984, Ba Lan năm 1996, Thổ Nhĩ Kỳ năm 2000, Brazil năm 2001, Serbia năm 2003, Thụy Sĩ năm 2005 (sửa đổi năm 2014), Nhật Bản và Trung Quốc năm 2008, Ấn Độ năm 2012 và Hàn Quốc năm 2014. Một vài năm trước, một nhóm nghiên cứu của Ủy ban ong mật Quốc tế (IHC) đã đề xuất sơ bộ về tiêu chuẩn dựa trên những thông tin họ thu thập được [9]. Bảng 1.3. Đề xuất hàm lượng của một số quốc gia và tổ chức [9] Thông số Giới hạn đề xuất của một số quốc gia IHC > 1,4 Thổ Nhĩ Kì > 1,4 Thụy Sĩ > 1,4 Hàm lượng 10-HDA (%) Nhật Bản > 1,4 Brazil > 2,0 Hàn Quốc > 1,4 Ấn Độ > 1,4 10
20. Thông số Giới hạn đề xuất của một số quốc gia Hàm lượng 10-HDA (%) Trung Quốc > 1,4 1.2.1. Một số nghiên cứu về 10-HDA Một số tính năng độc đáo và thú vị của sữa ong chúa có được là do sự có mặt của các chất béo. Axit béo chính trong sữa ong chúa là 10-HDA, một loại axit béo không bão hòa tự nhiên. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng 10-HDA thúc đẩy sự tăng trưởng của các tập hợp tế bào lympho T và interleukin-2, điều này có thể gợi ý là loại axit béo này có tác dụng ức chế miễn dịch và chống ung thư. Đây là một hướng điều trị có lợi để hạ đường huyết, chống lão hóa và khối u; vì vậy 10-HDA có giá trị quan trọng trong lĩnh vực điều trị y tế và chăm sóc sức khỏe [19]. a. Hoạt tính sinh học Hoạt tính chống ung thư của 10-HDA Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng sữa ong chúa giúp bảo vệ cơ thể khỏi bệnh ung thư. Sử dụng thường xuyên thậm chí có thể ngăn ngừa bệnh này xảy ra. Vào năm 1959, trên tạp chí Nature Publishing Group, Gordon F., Townsend và cộng sự đã khẳng định sữa ong chúa có khả năng chống u biếu. Nguyên nhân là vì trong sữa ong chúa có chứa nhiều loại axit béo, đặc biệt là 10-HAD. Sữa ong chúa có khả năng ngăn chặn sự phát triển khối u cổ trướng và bệnh bạch cầu ở AKR chuột [33, 34]. Vào năm 2007, Hiroshi Izuta [14] và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế đối với VEGF (vascular endothelial growth factor – yếu tố tăng trưởng mô mạch máu) trong tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con người (HUVECs – Human umbilical vein endothelial cells) gây ra sự hình thành tế bào, ức chế sự tăng sinh và di chuyển của tế bào ung thư dẫn đến ức chế mạch máu khối u. Ngoài ra, RJ cũng đã được chứng minh là có hoạt tính chống estrogen bằng cách ức chế sự tăng trưởng của bisphenol (BPA) – một loại estrogen kích thích sự tăng sinh của tế bào ung thư vú ở người 11
21. MCF-7 [21, 26]. Tuy nhiên, việc điều trị các tế bào MCF-7 bằng các hợp chất lipit trong RJ thì làm tăng sinh các tế bào này, nhưng điều trị đồng thời với tamoxifen thì sẽ ngăn chặn được sự tăng sinh của tế bào MCF-7, do các hợp lipit ức chế liên kết 17b-estradiol với ERb (estrogen b) nhưng không ảnh hưởng đến sự gắn kết của 17- bestradiol với Era (estrogen a) [22]. Vào năm 2017, Chi Chung Peng [9] và các cộng sự đã chứng minh rằng 10- HDA trong RJ có khả năng ức chế hoạt động tyrosinase, ức chế sự biểu hiện của melanogen bao gồm tyrosinase, TRP-1 và TRP-2 (tyrosinase-related protein 1 và 2) bằng cách ức chế MITF (microphthalmia-associated transcription factor) trong các tế bào u ác tính. Đo đó, làm giảm sắc tố của melanin trong tế bào u ác tính B16F10. Một bằng chứng chống ung thư khác là RJ có tác dụng kích thích miễn dịch, bằng cách ngăn chặn sự suy tủy gây ra bởi sự tiến hóa của khối u qua ức chế tạo máu lách ở những người mang khối u hạch (EAT - Ehrlich ascetic tumor) và điều trị tùy thuộc vào thời gian và liều RJ [8]. Hoạt tính chống oxi hóa của 10-HDA Khi peroxid hóa lipid bị ức chế trong ống nghiệm và trong các thí nghiệm trên chuột, 10-HDA đã được tìm thấy để bảo vệ tế bào DNA khỏi quá trình oxy hóa. Nghiên cứu về chế độ ăn kiêng RJ đối với chuột, người ta đã chứng minh rằng sau khi cho chuột ăn RJ trong 16 tuần, nồng độ 8- hydroxy-2-deoxyguanosin (một chất chống oxy hóa) đã giảm đáng kể trong DNA và huyết thanh của thận và tuổi thọ trung bình của chuột C3H / HeJ được tăng lên thông qua cơ chế chống oxy hóa [7, 38]. 10-Hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA), đã được chứng minh là làm tăng tuổi thọ của Caenorhabditis elegans (loài giun tròn) không thông qua insulin mà thông qua chế độ ăn kiêng và tín hiệu TOR (một loại protein trong người), cụ thể là ức chế mTOR để giảm quá trình lão hóa [41]. Hyejung Gu và các cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của sữa ong chúa sau khi được khử với enzyme (ERJ) bằng 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Tác dụng chống oxy hóa của ERJ là do giảm số phản ứng oxy hóa nội bào 12
22. (ROS) và sản sinh oxit nitric (NO) trong các đại thực bào. Hơn nữa, ERJ làm tăng hoạt động chống oxy hóa superoxide effutase (SOD) và glutathione (GSH). Các hoạt động chống oxy hóa này của ERJ mạnh hơn so với các hoạt động của RJ không được qua xử lý [15]. Một số hoạt tính khác Tác dụng nơron thần kinh: Theo dân gian, sữa ong chúa đã được biết đến để cải thiện trí nhớ, ngăn ngừa lão hóa, tăng năng lượng, giảm lo lắng và làm giảm tính hiếu động. 10-HDA của RJ có khả năng làm tăng sự sản sinh tế bào thần kinh và bảo vệ các tế bào thần kinh của não chuột trưởng thành [7]. Tác dụng kháng sinh, kháng viêm: Axit 10-hidroxy-2-decenoic cũng có hoạt tính kháng sinh chống lại một số vi khuẩn và nấm (trong đó có Micrococcus pyogenes, Escherichia coli, Neurospora sitophila). 10-HDA đã được nghiên cứu với chức năng chống viêm trên các tế bào ung thư ruột của con người (WiDr), cũng như tác dụng của nó đối với sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. 10-HDA đóng vai trò là chất diệt khuẩn mạnh chống lại mầm bệnh đặc trưng cho động vật hoặc người, bao gồm Staphylococcus aureus, Streptococcus alactolyticus, Staphylococcus trung gian B, Staphylococcus xylosus, Salmonella cholearasuis, Vibro parahaem. Điều đó cho thấy tiềm năng của nó như là khả năng chống viêm và diệt khuẩn để mang lại lợi ích cho đường tiêu hóa của con người [40]. Ngoài ra, 10-HDA còn có tác dụng làm đẹp, gia tăng sản xuất collagen. Trong một nghiên cứu in vitro, RJ đã thúc đẩy sự hiện diện sản xuất collagen của các nguyên bào sợi trong axit theascorbic-2-O-α-glucoside (AA2G) [7]. b. Phương pháp phân tích 10-HDA trong sữa ong chúa Xác định 10-HDA bằng phương pháp HPLC Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục 13
23. giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [11]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng phương pháp này, để phân tích 10-HDA có thể kể đến như: Năm 2007, Jinhui zhou [19] và các cộng sự đã xây dựng phương pháp xác định 10-HDA trong mẫu sữa ong chúa tươi và sữa ong chúa đông khô bằng phương pháp HPLC pha đảo với chất nội chuẩn methyl 4-hydroxybenzoat (MHB). Các điều kiện sắc kí được dùng để phân tích như sau: Cột sử dụng là cột C18 (3,9 nm 햷 150 nm 햷 5µm) với nhiệt độ 30oC, pha động là methanol : nước : axit photphoric có tỉ lệ 50 : 50 : 0,3 (v/v/v), với tốc độ dòng là 0,8 mL / phút, tổng thời gian chạy sắc kí để tách được 10-HDA là 7,2 phút. Trước khi bơm mẫu vào thiết bị HPLC, mẫu sữa ong chúa được chiết bằng etanol tuyệt đối và lọc bằng màng nilon 0,2 µm. Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình là 95,0 - 99,2% với RSD = 1,3% - 2,1%, giới hạn phát hiện LOD = 0,5 mg/kg, giới hạn định lượng là LOQ = 1,5 mg/kg . Năm 2010, Joonyeong Kim [20] và cộng sự đã nghiên cứu xác định hàm lượng 10-HDA trong sản phẩm sữa ong chúa bằng phương pháp HPLC và sử dụng chất nội chuẩn là methyl 4-hydroxybenzoat (MHB). Điều kiện sắc kí để phân tích 10-HDA như sau: Sử dụng cột XDB-C18 (150 nm 햷 4,6 nm) với nhiệt độ là 25oC, bước sóng UV là 215 nm, pha động là hỗn hợp metanol : nước : axit photphoric (55 : 45 : 2,7, v/v/v), với tốc độ dòng chảy là 1,0 mL / phút và tổng thời gian chạy sắc kí là 10 phút. Mẫu được chiết bằng metanol với tỉ lệ metanol : nước là 50 : 50 (v:v), rồi lọc qua màng nilon 0,2 µm và 0,45 µm rối sau đó được đưa vào thiết bị HPLC với thể tích bơm là 3 µL. Phương pháp phân tích cho độ thu hồi trung bình trong khoảng 97,4% - 100,4% với RSD = 2,4% - 3,4%, giới hạn phát hiện LOD = 0,05 µg/mL và giới hạn phát hiện LOQ = 0,25 µg/mL. Năm 2017, Ivana Flanjak [16] và các cộng sự đã xác định 10-HDA trong sữa ong chúa ở Croatia bằng phương pháp HPLC với detector UV, có bước sóng hấp thụ 14