Luận án Nghiên cứu thu nhận và tạo bột inulin từ củ đẳng sâm (Codonopsis Javanica) tự nhiên mọc tại Lạc Dương - Lâm Đồng

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thu nhận và tạo bột inulin từ củ đẳng sâm (Codonopsis Javanica) tự nhiên mọc tại Lạc Dương - Lâm Đồng

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THĂNG LONG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TẠO BỘT INULIN TỪ CỦ ĐẲNG SÂM (CODONOPSIS JAVANICA) TỰ NHIÊN MỌC TẠI LẠC DƯƠNG - LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA – 2021
2. BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THĂNG LONG NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ TẠO BỘT INULIN TỪ CỦ ĐẲNG SÂM (CODONOPSIS JAVANICA) TỰ NHIÊN MỌC TẠI LẠC DƯƠNG - LÂM ĐỒNG Chuyên ngành : Công nghệ Sau thu hoạch Mã số : 9540104 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1.PGS. TS. Vũ Ngọc Bội 2.PGS. TS. Đào Xuân Vinh KHÁNH HÒA – 2021
3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài:“Nghiên cứu tạo bột inulin từ củ đẳng sâm (Codonopsis javnica) tự nhiên mọc tại Lạc Dương - Lâm Đồng” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này. Các kết quả, số liệu nêu trong luận án là trung thực. Kết quả trong luận án này được tài trợ kinh phí từ Đề tài cấp Bộ GD-ĐT“Nghiên cứu thành phần hóa học của Đảng sâm (Codonopsis javanica) tại Lâm Đồng và ứng dụng tạo thực phẩm chức năng”. Mã số: B2018-DLA-01 mà tôi là chủ nhiệm đề tài. Khánh Hòa, ngày 15 tháng 10 năm 2021 NCS. Nguyễn Thị Thăng Long i
4. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo phòng Đào tạo Sau đại học và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi đến PGS.TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và PGS. TS. Đặng Xuân Vinh - Nguyên Giám đốc Viện Vaccin Đà Lạt đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Xin chân thành cám ơn các thầy cô phản biện đã góp ý và cho những lời khuyên quý báu để Luận án hoàn thành với chất lượng cao. Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Đà Lạt đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi được đi học và hoàn thành Luận án này. Xin cám ơn các thành viên tham gia đề tài cấp Bộ đã cùng tôi thực hiện đề tài để kết quả luận án chất lượng hơn. Xin gửi lời cám ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại trường. Đặc biệt, xin ghi nhớ và tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, chia sẻ khó khăn và động viên tôi để tôi hoàn thành Luận án này. Khánh Hòa, ngày 15 tháng 10 năm 2021 NCS. Nguyễn Thị Thăng Long ii
5. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH xii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xv MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỦ ĐẲNG SÂM 4 1.1.1. Phân loại và đặc điểm sinh học của cây đẳng sâm 4 1.1.2. Thành phần các chất cơ bản của các loài trong chi Codonopsis 5 1.1.3. Thời gian thu hái 6 1.2. XÁC ĐỊNH LOÀI VÀ ĐỘ TUỔI THẢO DƯỢC 7 1.2.1. Phương pháp truyền thống (nhận dạng macro) 7 1.2.2. Phương pháp hiện đại (nhận dạng micro) 8 1.3. FRUCTAN VÀ MỘT SỐ LOẠI THỰC VẬT CÓ INULIN 9 1.3.1. Giới thiệu về fructan 9 1.3.2. Một số loại thực vật giàu inulin 10 1.4. INULIN VÀ FOS 11 1.4.1. Cấu trúc và tính chất hóa học của inulin và FOS 11 1.4.2. Tác dụng sinh lý và ứng dụng Inulin/FOS 15 1.4.2.1. Tác dụng sinh lý 15 1.4.2.2. Ứng dụng của inulin/FOS 18 1.4.3. Kỹ thuật tách chiết và tinh sạch Inulin/FOS 19 1.4.3.1. Kỹ thuật tách chiết 19 1.4.3.2. Kỹ thuật tinh sạch inulin/FOS 21 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH INULIN/FRUCTAN 22 1.6. ỨNG DỤNG SẤY PHUN TRONG TẠO BỘT INULIN/FOS 23 1.61. Các chất mang 23 1.6.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sấy phun 25 iii
6. 1.7. PREBIOTIC 25 1.8. PROBIOTIC 27 1.8.1. Vi khuẩn Bifidobacterium 28 1.8.2. Vi khuẩn Lactobacillus 29 1.9. SYNBIOTIC 30 1.10. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÁC LOÀI TRONG CHI CODONOPSIS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 30 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 33 2.1.1. Củ đẳng sâm nguyên liệu 33 2.1.2. Chất mang 33 2.1.3. Giống vi sinh vật 33 2.1.4. Chuột dùng trong thử nghiệm 34 2.2. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 34 2.2.1. Phương pháp thu, lấy mẫu và xử lý mẫu 34 2.2.2. Bố trí thí nghiệm tổng quát 35 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định một số công đoạn chính 37 2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 41 2.3.1. Phương pháp phân tích hình thái và cấu trúc mô củ đảng sâm 41 2.3.2. Các phương pháp định tính một số nhóm chất trong đảng sâm 42 2.3.3. Các phương pháp định lượng hóa học 42 2.3.4. Phương pháp tinh sạch inulin 43 2.3.5. Các phương pháp phân tích khối lượng phân tử và cấu trúc inulin 43 2.3.6. Phương pháp đánh giá chất lượng bột thành phẩm 44 2.3.7. Phương pháp định lượng vi sinh vật 45 2.3.8. Đánh giá hoạt tính prebiotic 45 2.3.9. Phương pháp thử nghiệm chế phẩm synbiotic trên chuột thí nghiệm 46 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 50 2.5. THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ VẬT TƯ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 51 2.5.1. Thiết bị 51 2.5.2. Hóa chất 51 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 iv
7. 3.1. NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THỜI GIAN THU HOẠCH NGUYÊN LIỆU CỦ ĐẲNG SÂM TỰ NHIÊN MỌC TẠI LẠC DƯƠNG - LÂM ĐỒNG 52 3.1.1. Ảnh hưởng của độ tuổi đến hình thái và cấu trúc mô của củ đẳng sâm 52 3.1.2. Ảnh hưởng của độ tuổi đến thành phần các chất của củ đẳng sâm 57 3.1.3. Đánh giá chất lượng của củ đẳng sâm mọc tại Lạc Dương - Lâm Đồng 68 3.2. NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH CHIẾT INULIN TỪ CỦ ĐẲNG SÂM TỰ NHIÊN MỌC TẠI LẠC DƯƠNG LÂM ĐỒNG 69 3.2.1. Xác định thông số biên cho quá trình tối ưu hóa công đoạn chiết inulin từ đẳng sâm 69 3.2.2. Tối ưu hóa công đoạn chiết inulin từ củ đẳng sâm theo phương pháp Box- Benken 72 3.2.3. Đề xuất qui trình chiết inulin từ củ đẳng sâm 79 3.3. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÔNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH KẾT TỦA INULIN TỪ DỊCH CHIẾT CỦ ĐẲNG SÂM 80 3.3.1. Xác định dung môi và nồng độ dung môi kết tủa inulin 80 3.3.2. Xác định nồng độ ethanol 83 3.3.3. Xác định nhiệt độ cô đặc dịch chiết inulin từ đẳng sâm 85 3.3.4. Xác định nhiệt độ kết tủa inulin từ dịch chiết 88 3.4. NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA PHÂN TỬ INULIN 90 3.4.1. Nghiên cứu tinh sạch inulin 90 3.4.2. Đề xuất quy trình tinh sạch inulin từ củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng 92 3.4.3. Xác định đặc điểm cấu trúc phân tử inulin 94 3.5. NGHIÊN CỨU SẤY PHUN TẠO BỘT INULIN CỦ ĐẲNG SÂM 99 3.5.1. Xác định chất mang và tỷ lệ chất mang 99 3.5.2. Xác định nhiệt độ khí đầu vào 109 3.5.3. Đề xuất quy trình sấy phun tạo bột inulin củ đẳng sâm và sản xuất thử 111 3.6. THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG INULIN CỦ ĐẲNG SÂM TẠO BỘT SYNBIOTIC ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM 115 3.6.1. Ảnh hưởng của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun đến sự phát triển của một số loại vi probiotic 115 v
8. 3.6.2. Tối ưu hóa công đoạn phối trộn bột inulin củ đẳng sâm với sinh khối vi khuẩn tạo chế phẩm synbiotic 116 3.7. THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SYNBIOTIC TRÊN CHUỘT THÍ NGHIỆM 124 3.7.1. Thử nghiệm độc tính cấp 124 3.7.2. Tác động điều trị tiêu chảy cấp của chế phẩm synbiotic 125 3.7.3. Tác động kích thích miễn dịch của chế phẩm synbiotic 127 3.7.4. Thử nghiệm độc tính bán trường diễn của chế phẩm synbiotic 130 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO 0 PHỤ LỤC PL-1 vi
9. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải nghĩa CFU : Colon form unit - Đơn vị khuẩn lạc CoA : Coenzyme A CV : Coefficient of variation - Hệ số biến thiên Da : Dalton - Đơn vị đo khối lượng phân tử một chất DĐVN : Dược Điển Việt Nam DE : Design Expert - Thiết kế chuyên nghiệp ĐK : Đường kính DM/NL : Dung Môi/Nguyên Liệu DPav : DP average - Mức độ polymer trung bình DPn : Degree polymer - Mức độ polymer hóa ĐS : Đẳng sâm FDA : Food and Drug Administration - Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc (USA) FOS : Fructo-oligosaccharide - Inulin mạch ngắn FT-IR : Fourrier transformation infrared spectroscopy - Quang phổ hồng ngoại GA : Gum Arabic - Một loại phụ gia thực phẩm GALT : Gut associated lymphoid tissue - Mô bạch huyết liên quan đến ruột GAP : Good agricutural practice - Thực hành nông nghiệp tốt GC : Gas chromatography- Sắc ký khí GC-MS : Gas chromatography-Mass spectrometry- sắc ký khí ghép nối đầu dò khối phổ GFn : -D-Glucopyranosyl-[Β-D-Fructofuranosyl](n-1)-β-D- fructopyranosis- Tên gọi inulin dạng GFn GIT : Gastrointestinal tract - Đường tiêu hóa GLP : Glucagon low peptide - Peptide đơn giản GLP : Glucagon GPCR : G - protein HDACs : Histone deacetylase - Một loại enzyme HMT : Hàm mục tiêu vii
10. HPLC : High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng hiệu năng cao IBD : Inflammatory bowel diseases – Bệnh dị ứng IFγ : Interferon gamma- Tên một loại khán ghteer IgA : Immunoglobulin A - Kháng thể IgA IL : Interleukin IMO : Isomalto - Oligosacaride IN/OF : inulin/oligofructose KPH : Không phát hiện LAB : Lactobacillus LC : Liquid chromatography - Sắc ký lỏng MALDI-MS : Matrix assisted laser desorption ionization time of flight-Mass Spectrometry MD : Maltodextrin-Một loại phụ gia thực phẩm mPa.s : Centi Poise (cP = mPa.s) - Đơn vị đo độ nhớt thường dùng MPN : Most probable number - Đếm số khuẩn lạc MS : Mass spectrometry - Khối phổ NDOs : Nondigestible oligosaccharide - Xơ không tiêu hóa được dạng mạch ngắn NK : Natural kill - Tế bào giết tự nhiên NMR : Nuclear magnetic resonance spectroscopy - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PS : Polysaccharide PTN : Phòng thí nghiệm PƯ : Phản ứng QĐ : Quyết định QĐ-ATTP : Quyết định - An toàn thực phẩm QTLC : Quality thin layer chromatography - Chất lượng sắc ký lớp mỏng RH : Rate humidity - Độ ẩm RI : Refractive Index detector - Đầu dò chiết xuất (trong máy chuyên dụng) rpm : Revolutions per minute - Số vòng quay trong một phút SCFA : Short chain fatty acid - Acid béo chuỗi ngắn/ mạch ngắn SK : Sinh khối viii
11. SOS : Soy bean oligosaccharide - Oligosaccharide nguồn gốc đậu tương Std : Standard deviation - Độ lệch chuẩn trong thống kê TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TH : T Helper - Tế bào T giúp TL : Tỉ lệ TLC : Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp mỏng TLPT : Trọng lượng phân tử TPCN : Thực phẩm chức năng TT : Thuốc thử UBND : Ủy ban nhân dân USDA : US Food and Drug Administration - Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ UV-VIS : Ultravisible - Ultraviolet spectroscopy v/p : Vòng/phút v Volume -Thể tích VN : Việt Nam VSV : Vi sinh vật VSVHK : Vi sinh vật hiếu khí w : Weight - Khối lượng WHO : World Health Organization - Tổ chức Y tế Thế giới XS : Xác suất SK : Sinh khối ix
12. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số dạng fructan tìm thấy ở một số loài sinh vật 9 Bảng 1.2. Một số loài thực vật giàu Inulin 10 Bảng 1.3. Hàm lượng inulin của một số loại thực vật 11 Bảng 1. 1. Các dung dịch glucose chuẩn 13 Bảng 1. 2. Tổ hợp thực nghiệm tối ưu hóa 15 Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 2.2. Mã hóa các biến độc lập đầu vào 38 Bảng 2.3. Các biến độc lập đầu vào và mức độ được sử dụng trong thiết kế 39 Bảng 2.4. Xác định độ hòa tan 45 Bảng 2.5.Thang điểm đánh giá tiêu chảy ở chuột 47 Bảng 2.6. Phân lô thử nghiệm độc tính bán trường diễn 49 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của độ tuổi đến kích thước đường kính củ đẳng sâm 55 Bảng 3.2. Kết quả phân tích giải phẫu mô của củ đẳng sâm dưới kính hiển vi 56 Bảng 3.3. Kết quả phân tích định tính một số các nhóm chất hữu cơ có trong củ đẳng sâm 3 năm tuổi 58 Bảng 3.4. Hàm lượng một số kim loại nặng và tạp chất vô cơ của củ đẳng sâm ở các độ tuổi khác nhau 63 Bảng 3.5. Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết củ đẳng sâm ở các độ tuổi khác nhau 63 Bảng 3.6. Hàm lượng các chất của củ đẳng sâm theo năm tuổi 68 Bảng 3.7. Biến mã và các biến thực trong thí nghiệm tối ưu hóa 72 Bảng 3.8. Thiết kế thí nghiệm theo mô hình Box-Behnken và kết quả 72 Bảng 3.9. Mật độ xác suất của các hàm mục tiêu 74 Bảng 3.10. Kết quả dự đoán các thông số tối ưu 76 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi đến hàm lượng saccharide toàn phần, inulin và fructan thu được sau kết tủa 81 Bảng 3.12. Kết quả kết tủa inulin và fuctan ở các nhiệt độ khác nhau 89 Bảng 3.13. Hiệu suất thu hồi inulin củ đẳng sâm qua các giai đoạn tái kết tủa 90 Bảng 3.14. Kết quả tính toán chỉ số Rf của inulin củ đẳng sâm tinh sạch trên sắc ký bản mỏng silicagel 91 Bảng 3.15. Kết quả phân tích khối lượng phân tử của các thành phần polysachride của củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng 94 Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của inulin tinh sạch từ củ đẳng sâm 98 x
13. Bảng 3.17. Kích thước hạt và độ phân tán của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun sử dụng các chất mang khác nhau 101 Bảng 3.18. Tính chất nhiệt của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun sử dụng các chất mang khác nhau 101 Bảng 3.19. Hàm lượng Inulin và tính chất cảm quan của các loại bột sấy phun 102 Bảng 3.20. Kích thước hạt và PDI của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun với nồng độ maltodextrin khác nhau 106 Bảng 3.21. Kích thước hạt và PDI của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun với nhiệt độ khí đầu vào khác nhau 110 Bảng 3.22. Kết quả phân tích một số thành phần và đặc tính của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun thành phẩm 113 Bảng 3.23. Kết quả nuôi tăng sinh khối vi khuẩn trong môi trường bổ sung bột inulin củ đẳng sâm sấy phun 115 Bảng 3.24. Tổ hợp phối trộn prebiotic và probiotic 118 Bảng 3.25. Kết quả phân tích Anova các hàm mục tiêu Yi 119 Bảng 3.26. Mật độ xác suất của các hàm mục tiêu 121 Bảng 3.27. Kết quả dự đoán các thông số tối ưu 122 Bảng 3.28. Kết quả kiểm tra lại một số tổ hợp có mật độ khuẩn lạc cao nhất 123 Bảng 3.29. Kết quả cân trọng lượng chuột thử nghiệm độc tính cấp 124 Bảng 3.30. Kết quả đánh giá trọng lượng cơ thể chuột thử nghiệm tiêu chảy cấp 125 Bảng 3.31. Kết quả phân tích công thức máu của chuột trước thử nghiệm 127 Bảng 3.32. Kết quả đánh giá trọng lượng cơ thể chuột ở các lô thử nghiệm 127 Bảng 3.33. Trọng lượng tương đối của một số cơ quan miễn dịch ở chuột 128 Bảng 3.34. Sự thay đổi về số lượng và công thức bạch cầu (BC) của chuột ở các lô thử nghiệm 128 Bảng 3.35. Kết quả phân tích công thức máu của chuột thử nghiệm 128 Bảng 3.36. Kết quả phân tích công thức máu và chức năng gan, thận của chuột dùng trong thí nghiệm 131 Bảng 3.37. Cân nặng trung bình của chuột theo thời gian ở các lô thí nghiệm 131 Bảng 3.38. Kết quả phân tích huyết học của chuột sau 14 và 28 ngày thử nghiệm 132 Bảng 3.39. Chỉ số chức năng gan ở chuột sau 14 và 28 ngày thử nghiệm 133 Bảng 3.40. Chỉ số chức năng thận ở chuột sau 14 và 28 ngày thử nghiệm 134 Bảng 3.41. Kết quả phân tích vi thể cấu trúc tế bào gan của các lô thử nghiệm 138 Bảng 3.42. Kết quả phân tích vi thể cấu trúc tế bào thận của các lô thử nghiệm 140 xi
14. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Ảnh về cây, củ và hoa đẳng sâm (C. javanica) (Ảnh do luận án chụp) 4 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của sucrose và fructan 12 Hình 1.3. Phản ứng tạo màu với Resorcinol của inulin/FOS và các chất khác 23 Hình 1.4. Phân tử gum từ Acacia senegal 24 Hình 1.1. Sơ đồ phân loại đảng sâm theo năm tăng trưởng 1 Hình 1.2. Sơ đồ tối ưu hóa quá trình chiết 15 Hình 1.3. Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của dung môi 16 Hình 1.4. Sơ đồ xác định nồng độ dung môi thích hợp 16 Hình 1.5. Sơ đồ xác định nhiệt độ thích hợp khi cô đặc chân không 17 Hình 1.6. Sơ đồ khảo sát và xác định nhiệt độ kết tủa inulin 18 Hình 1.7. Sơ đồ khảo sát lựa chọn chất mang 19 Hình 1.8. Sơ đồ khảo sát chế độ sấy 19 Hình 1.9. Sơ đồ đánh giá chất lượng bột đảng sâm thành phẩm 20 Hình 1.10. Sơ đồ đánh giá hoạt tính Prebiotic 21 Hình 2.1. Mẫu củ đẳng sâm 33 Hình 2.2. Vị trí thu mẫu 33 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 36 Hình 2.4. Mô hình tối ưu hóa 38 Hình 2.5. Mô hình tối ưu hóa 40 Hình 2.6. Các đặc điểm nhận dạng mô củ đẳng sâm 41 Hình 2.7. Sơ đồ phương pháp trải đĩa 46 Hình 3.1. Hình dạng và mầu sắc bên ngoài của củ đẳng sâm theo năm tuổi 52 Hình 3.2. Hình ảnh về vết sẹo hàng năm trên cổ củ đẳng sâm 52 Hình 3.3. Hình ảnh bề mặt lát cắt của củ đẳng sâm tươi và khô 52 Hình 3.4. Hình ảnh bề mặt lát cắt ngang nhộm màu của củ đẳng sâm tươi 52 Hình 3.5. Hình ảnh vòng tăng trưởng của củ đẳng sâm 53 Hình 3.6. Hình ảnh bột củ đẳng sâm (a), tinh thể inulin (b) và hình ảnh vi phẫu của củ đẳng sâm dưới kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 1.25 53 Hình 3.7. Sự thay đổi về tỷ lệ giữa xylem và phloem của củ đẳng sâm 57 Hình 3.8. Sắc ký đồ bản mỏng silicagel dịch chiết inulin củ đẳng sâm 1, 2 và 3 năm tuổi với hệ dung môi chloroform: acid axetic: nước theo tỉ lệ 7:6:1 59 xii
15. Hình 3.9. Sự thay đổi của hàm lượng đường tổng số ở củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng theo độ tuổi 60 Hình 3.10. Sự thay đổi của tổng chất chiết hòa tan ở củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng theo độ tuổi 60 Hình 3.11. Sự thay đổi của hàm lượng tro tổng số ở củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng theo độ tuổi 61 Hình 3.12. Mô hình tương quan và hồi quy của đường (a), chất chiết hòa tan (b) và hàm lượng tro chất (c) ở củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương-Lâm Đồng theo độ tuổi 61 Hình 3.13. Sự thay đổi của hàm lượng inulin ở củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng theo độ tuổi 62 Hình 3.14. Mối tương quan giữa hàm lượng inulin (a), polyphenol (b) và Flavonoid (c) theo độ tuổi 62 Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng inulin chiết 69 Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng inulin trong dịch chiết 70 Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hàm lượng inulin chiết từ củ 71 Hình 3.18. Mô hình 2D, 3D bề mặt đáp ứng tiên đoán điểm tối ưu của các hàm mục tiêu dưới tác động của các yếu tố đầu vào 75 Hình 3.19. Kết quả trùng lắp các mặt đáp ứng 76 Hình 3.20. Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng Inulin, fructan và tổng chất chiết hòa tan của dịch chiết đẳng sâm 78 Hình 3.21. Quy trình chiết inulin từ củ đẳng sâm tự nhiên 79 Hình 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến sự thay đổi hàm lượng saccharide thu được sau kết tủa 84 Hình 3.23. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đến hàm lượng inulin của dịch cô đặc 86 Hình 3.24. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đến hàm lượng Fructan của dịch cô đặc 87 Hình 3.25. Hình ảnh sắc ký bản mỏng trên silicagel chế phẩm inulin tinh sạch với hệ dung môi chloroform: acetic acid: nước là 7:6:1 91 Hình 3. 26. Qui trình tinh sạch inulin từ dịch chiết đẳng sâm 92 Hình 3.27. Sắc ký đồ chế phẩm polysacchride tinh sạch trên sắc ký rây phân tử hiệu năng cao (sắc ký lọc gel) 94 Hình 3.28. Phổ IR của inulin thương mại (Chicory Inulin - OraftiR GR) 95 Hình 3.29. Phổ FT-IR của inulin củ đẳng sâm tinh sạch 95 13 Hình 3.30. Phổ C-NMR (D2O, 125 MHz) của inulin củ đẳng sâm tinh sạch 96 xiii
16. Hình 3.31. Phổ DEPT của inulin củ đẳng sâm tinh sạch 96 1 Hình 3.32. Phổ H-NMR (D2O, 500 MHz) của inulin củ đẳng sâm tinh sạch 96 Hình 3.33. Phổ HSQC của inulin củ đẳng sâm tinh sạch 97 Hình 3.34. Phổ HMBC của inulin củ đẳng sâm tinh sạch 98 Hình 3.35. Cấu trúc hóa học của inulin củ đẳng sâm mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng 99 Hình 3.36. Giản đồ phân tích kích thước hạt và độ phân tán của bột 100 Hình 3.37. Giản đồ phân tích nhiệt vi sai bột inulin củ đẳng sâm sấy phun sử dụng các chất mang khác nhau 101 Hình 3.38. Giản đồ phân tích kích thước hạt và độ phân tán của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun với nồng độ maltodextrin khác nhau 105 Hình 3.39. Giản đồ phân tích nhiệt của mẫu inulin đẳng sấy phun với tỷ lệ maltodextrin khác nhau 106 Hình 3.40. Sự thay đổi hàm lượng inulin và fructan của các mẫu bột inulin củ đẳng sâm sấy phun với tỷ lệ maltodextrin sử dụng khác nhau 108 Hình 3.41. Giản đồ phân tích kích thước hạt và độ phân tán của bột inulin củ đẳng sâm sấy phun với nhiệt độ khí đầu vào khác nhau 109 Hình 3.42. Qui trình sấy phun tạo bột inulin củ đẳng sâm 111 Hình 3.43. Phổ FT- IR của bột inulin củ đẳng sâm tinh sạch và sấy phun 112 Hình 3.44. Mô hình 2D, 3D của các hàm mục tiêu Yi dưới tác động của các yếu tố đầu vào 120 Hình 3.45. Kết quả trùng lắp các mặt đáp ứng 122 Hình 3.46. Hình ảnh về tình trạng phân bình thường và phân chuột bị tiêu chảy 125 Hình 3.47. Sự thay đổi tổng điểm tiêu chảy ở các lô chuột thử nghiệm theo thời gian thí nghiệm 126 Hình 3.48. Vi thể tế bào gan của chuột ở lô sinh lý sau 28 ngày 137 Hình 3.49. Vi thể tế bào gan của chuột ở lô uống Synbiotic liều 1,2 g/kg sau 28 ngày 137 Hình 3.50. Vi thể tế bào gan của chuột ở lô uống Synbiotic liều 2,4 g/kg sau 28 ngày 137 Hình 3.51. Vi thể tế bào thận của chuột ở lô sinh lý sau 28 ngày 139 Hình 3.52. Vi thể tế bào thận của chuột ở lô uống Synbiotic liều 1,2 g/kg sau 28 ngày 139 Hình 3.53. Vi thể tế bào thận của chuột ở lô uống Synbiotic liều 2,4 g/kg sau 28 ngày 140 xiv
17. TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận và tạo bột inulin từ củ đẳng sâm (Codonopsis javanica) tự nhiên mọc tại Lạc Dương - Lâm Đồng Chuyên ngành: Công nghệ Sau thu hoạch Mã số: 9540104 Nghiên cứu sinh: Nguyễn Thị Thăng Long Khóa: 2015-2019 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Vũ Ngọc Bội 2. PGS.TS. Đào Xuân Vinh Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sấy phun tạo bột củ đẳng sâm (Codonopsis javanica) và tạo chế phẩm synbiotic từ bột củ đẳng sâm định hướng ứng dụng trong thực phẩm chức năng: 1) Luận án đã xác định được các đặc điểm hình thái và cấu trúc mô củ đẳng sâm (Codonopsis javanica) mọc tự nhiên ở Lạc Dương - Lâm Đồng làm cơ sở phân biệt độ tuổi và thời gian thu hoạch củ đẳng sâm. Mặt khác, luận án cũng xác định được củ đẳng sâm 3 năm tuổi có thành phần các chất đạt tiêu chuẩn DĐVN V, (2017): Hàm lượng đường tổng số:(10,08 ±0,88) oBx, hàm lượng chất chiết tổng số: (58,2 ± 1,57) %; hàm lượng tro tổng số:(5,50± 0,17) %, không chứa tạp chất vô cơ và kim loại nặng. 2) Luận án đã xác định được các thông số tối ưu cho quá trình chiết inulin từ Củ đẳng sâm (Codonopsis javanica) tự nhiên mọc tại Lạc Dương Lâm Đồng: dung môi chiết là nước cất hai lần, nhiệt độ chiết 71oC, thời gian chiết 36 phút và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 47ml/g với hiệu suất chiết inulin củ đẳng sâm đạt 23,93%, fructan 26,96% và tổng chất chiết hòa tan đạt 61,35%. Luận án cũng xác định được các yếu tố thích hợp cho quá trình kết tủa thu inulin: nhiệt độ thích hợp để cô đặc dịch chiết trước khi kết tủa đến 16oBx là 55oC, tác nhân kết tủa thích hợp là ethanol, nồng độ ethanol thích hợp cho quá trình kết tủa inulin là 80% và nồng độ ethanol thích hợp cho quá trình kết tủa fructan là 90%, nhiệt độ thích hợp để lắng kết tủa inulin là (6±1) oC với hiệu suất kết tủa trung bình đạt 95,53%. 3) Luận án lần đầu tiên tinh sạch và xác định đặc điểm cấu trúc của phân tử inulin của củ đẳng sâm (Codonopsis javanica) tự nhiên mọc tại Lạc Dương Lâm Đồng. Kết quả nghiên cứu cho thấy có thể tinh sạch inulin từ dịch chiết thô bằng phương pháp kết tủa lại nhiều lần (6 lần) bằng ethanol ở nồng độ gây kết tủa 80% với hiệu suất thu inulin tinh sạch là (75,85±0,84)%. Inulin tinh sạch thu nhận từ củ đẳng sâm (Codonopsis javanica) mọc tự nhiên tại Lạc Dương - Lâm Đồng gồm 2 phân tử fructose polysacccharid: một phân tử có xv
18. khối lượng 3.193 Da, có 19-23 đơn phân, chiếm 96,448% và một phân tử có khối lượng phân tử 1.112.892 Da, chiếm 3,552%. 4) Luận án lần đầu tiên xác định được một số thông số thích hợp cho quá trình sấy phun tạo bột inulin củ đẳng sâm (Codonopsis javanica): chất trợ sấy là maltodextrin, với tỷ lệ maltodextrin bổ sung thích hợp là 10%, nhiệt độ khi đầu vào 185oC và nhiệt độ không khí buồng sấy là 85oC, áp suất khí nén 3 atm, tốc độ bơm nhập liệu 10 ml/p, tương ứng với tốc độ đĩa phun 16.000 v/p. Bột inulin củ đẳng sâm sấy phun có hàm lượng inulin đạt (445,90±2,79) mg/g; hàm lượng Fructan đạt (469,40±1,61) mg/g, pH (5,18±0,01), hàm lượng tro (4,82±0,07) %. Độ hòa tan: 1/9,5±0,5/15 (g/ml/phút; Độ ẩm (6,06±0,27) % và không chứa tạp chất vô cơ và kim loại nặng. Bột inulin củ đẳng sâm có kích thước hạt (882,2±101,4)m, mật độ hạt 100 %, độ phân tán 0,497 DPI, nhiệt độ nóng chảy trên 600oC. Bột inulin củ đẳng sâm đạt tiêu chuẩn ATVSTP theo qui định hiện hành của Bộ Y tế đối với thực phẩm chức năng. 5) Luận án lần đầu tiên tiến hành sử dụng bột inulin củ đẳng sâm tạo chế phẩm synbiotic để định hướng ứng dụng trong thực phẩm và thu được một số kết quả: Bột inulin đảng sâm có đặc tính prebiotic mạnh với liều sử dụng 4% (tương đương 1,8-2% tính theo lượng inulin) có thể kích tăng sinh tế bào (CFU) của 8 chủng (2 chủng L. acidophillus, L. plantarum, L. rhamnosus, B. longum, B. lactic, Enterococcus faecalis) từ 1,4÷11,5 lần, trong đó L. acidophillus đạt mức tăng sinh cao nhất là 2,3 x1011CFU/g và vi khuẩn Enterococcus faecalis đạt mức tăng sinh thấp nhất là 7x106 CFU/g. 6) Luận án xác định được công thức phối trộn tạo bột synbiotic: Bột inulin củ đẳng sâm 0,514 g/g, sinh khối L. acidophillus (5x1010 CFU/g) 0,22 g/g; sinh khối L. plantarum (2 x 1011 CFU/g) 0,128 g/g; sinh khối B. longum (8 x1010 CFU/g) 0,033 g/g và sinh khối B. lactiCs (1011 CFU/g) 0,1g/g. 7) Kết quả thử nghiệm chế phẩm synbiotic trên chuột nhắt cho thấy chế phẩm synbiotic với liều sử dụng liều 1,2 g/kg và 2,4 g/kg trong 14 hoặc 28 ngày không độc, không ảnh hưởng đến chức năng của gan, thận ở chuột thử nghiệm và chế phẩm synbiotic có khả năng kích thích miễn dịch cũng như có khả năng điều trị tiêu chảy ở chuột nhắt. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH PGS.TS. Vũ Ngọc Bội PGS.TS. Đào Xuân Vinh Nguyễn Thị Thăng Long xvi
19. THE SUMMARY OF NEW CONTRIBUTIONS OF THE THESIS Thesis topic: Research on receiving and creating inulin powder from Codonopsis javanica naturally grown in Lac Duong Dist-Lam Dong province. Major: Post-Harvest Technology Code: 9540104 The Student of Ph.D. Nguyen Thi Thang Long. Course: 2015-2019 Instructors: 1. Assoc.Prof.Dr. Vu Ngoc Boi 2. Assoc.Prof.Dr. Dao Xuan Vinh Training institution: Nha Trang University Contents: The thesis has obtained some new results added to the field of research, spray drying to create inulin powder from Dangshen (Codonopsis javanica) and making synbiotic preparations from inulin for application in functional foods: 1)The thesis has researched and determined for the first time the morphological and structural features of the isotropic root tissue (Codonopsis javanica) that grows naturally in Lac Duong - Lam Dong as the basis for age discrimination and timing. Harvesting Dangshen roots. On the other hand, the thesis also determined that 3-year-old Dangshen root has ingredients that meet Vietnamese pharmacopeia standards in 2017: Total sugar content: (10.08 ± 0.88) oBx, Total extract content:(58.2 ± 1.57) g/100g; Total mineral content: (5.50 ± 0.17) %, containing inorganic impurities and heavy metals. 2)The thesis has first time researched and optimized the inulin extraction process from Codonopsis javanica that naturally grows in Lac Duong Lam Dong: the extraction solvent is distilled water, extraction temperature 71oC, extraction time, 36 minutes, and the ratio of solvents / raw materials is 47ml/g with 23.93% inulin extract, 26.96 % fructan, and 61.35 % of total dissolved extracts. The thesis also identifies the right factors for inulin precipitation: the appropriate temperature to concentrate the extraction before precipitating to 16 oBx is under 55oC, the suitable precipitation agent is ethanol, the concentration of ethanol is fit. The content for inulin precipitation is 80%, and ethanol concentration for fructan precipitation is 90%, temperature for inulin precipitation is (6 ± 1) °C with average precipitation efficiency of 95.53%. 3) The thesis studies for the first time on purification and determination of the molecular structure characteristiCs of inulin obtained. The study results showed that it is possible to purify inulin from crude extracts by recrystallization six times, and the purified inulin collection efficiency is (75.85±0.84) %. The purified inulin obtained from Codonopsis javanica naturally grows in Lac Duong - Lam Dong province includes two molecules of Fructose polysaccharide: a molecular with a mass of 3,193 Da, about 19-23 monomers, depict at xvii
20. 96,448%, and the other molecular has a molecular weight of 1,112,892 Da, accounting for 3,552%. 4) The dissertation identifies for the first time some parameters suitable for the spray Dangshen powdered in Codonopsis javanica. The drying aid is maltodextrin, with the appropriate additional maltodextrin ratio of 10 %. The inlet temperature is 185oC, and the drying chamber air temperature is 85oC; The compressed air pressure is 3 atm, the input pump speed is 10ml/p, which corresponds to the injector speed of 16,000 rm. The powder obtained had an inulin content of (445.90 ± 2.79) mg/g; Fructan content reached (469.40 ±1.61) mg/g, pH (5.18 ± 0.01), mineral content (4.82 ± 0.07) %. Solubility: 1/ 9.5 ± 0.5 / 15 (g / ml/ min; Humidity (6.06 ± 0.27) % and free of inorganic impurities and heavy metals. particle size (882.2±101.4) ƞm, particle density 100%, dispersion 0.497 DPI, melting temperature over 600oC. The powder meets food safety standards according to current regulations of the Ministry of Health for functional food. 5) The thesis has done for the first time by using powder from Dangshen to make synbiotic products to apply in food and obtained some results: Dangshen spray-powder containing Inulin has strong prebiotic properties with a dose of 4% (w/w- equivalent to 1.8- 2% based on inulin content) can stimulate cell proliferation (CFU) of 6 strains (L. acidophilus, L. plantarum, L. rhamnosus, B. longum, B. lactic, Enterococcus faecalis) from 1,4 ÷ 11.5 times, in which, L. acidophillus had the highest fertility rate of 2.3 x1011CFU/ g and Enterococcus faecalis had the lowest fertility rate of 7x10 6 CFU/ g. 6) The thesis first has identified the synbiotic mixing formula for the first time: dangshen powder 0.514 g/g mixed with L. acidophillus biomass 0.33 g/g (density 5x1010CFU/ g); 0.128 g/ g L. plantarum biomass (density 2x1011CFU/ g); 0.033 g/g B. longum (density 8 x 1010CFU / g) and 0.1 g/ g of B. lactiCs biomass (density 1011CFU/ g). 7) The thesis tests synbiotic products for the first time in mice. Results, synbiotic's doses of 1.2 g/ kg and 2.4 g/ kg using for 14 or 28 days were not acute toxicity, semi-chronic toxicity to the liver's function, and to the kidney in test rats. Synbiotic has immunostimulating properties as well as the ability to treat diarrhea in mice. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH Assoc.Prof.Dr. Vũ Ngọc Bội Assoc.Prof.Dr.Đào Xuân Vinh Nguyễn Thị Thăng Long xviii