Luận án Nghiên cứu thu nhận dịch Protein thủy phân và Hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hướng ứng dụng trong thức ăn nuôi Tôm thẻ chân trắng

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thu nhận dịch Protein thủy phân và Hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hướng ứng dụng trong thức ăn nuôi Tôm thẻ chân trắng

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ___ PHẠM VIẾT NAM NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH PROTEIN THỦY PHÂN VÀ HYDROXYAPATITE TỪ PHẾ LIỆU CÁ TRA, ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG THỨC ĂN NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA – 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ___ PHẠM VIẾT NAM NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH PROTEIN THỦY PHÂN VÀ HYDROXYAPATITE TỪ PHẾ LIỆU CÁ TRA, ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG THỨC ĂN NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH ĐÀO TẠO: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN MÃ SỐ: 9540105 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Trang Sĩ Trung PGS.TS. Nguyễn Văn Hòa KHÁNH HÒA – 2021
3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình do tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình. Tác giả luận án Phạm Viết Nam iii
4. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này tôi xin gửi lời tri ân đến Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Thực phẩm, Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, Phòng Đào tạo Sau đại học đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM, Ban Lãnh đạo Khoa Thủy sản đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Trang Sĩ Trung và PGS.TS. Nguyễn Văn Hòa đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS. Willem F. Stevens đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên khích lệ và dành nhiều thời gian Trao đổi về chuyên môn với tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Trần Vỹ Hích, TS. Đinh Văn Khƣơng, TS. Hoàng Ngọc Cƣơng, TS. Nguyễn Công Minh, TS. Nguyễn Văn Tặng, ThS. Phạm Thị Đan Phƣợng, các cán bộ kỹ thuật của Trung tâm Thí nghiệm Thực hành Trƣờng Đại học Nha Trang, Trƣờng Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM, Ban Lãnh đạo Công ty Cổ phần Nam Việt – An Giang, các em học viên cao học khóa 2015 – 2017, 2016 – 2018, các em sinh viên khóa K5, K6, K7, K8 - Khoa Thủy sản đã đồng hành giúp đỡ, động viên, khích lệ và chia sẽ cho tôi nhiều kinh nghiệm trong quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ, chia sẻ mọi khó khăn để luận án đƣợc hoàn thành. Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Khánh Hoà, ngày 12 tháng 08 năm 2021 Tác giả luận án Phạm Viết Nam iv
5. DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AOAC Association of Official Hiệp hội các nhà hoá phân tích Analytical Chemists chính thống ANOVA Analysis of Variance Phân tích phƣơng sai HA Hydroxyapatite Hydroxyapatite FPH Fish Protein Hydrolysate Dịch protein thủy phân cá DH Degree Hydrolysis Độ thủy phân NR Nitrogen Recovery Hiệu suất thu hồi nitơ HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel wt.% Weight percentage Phần trăm theo khối lƣợng Nd Not detected Không phát hiện JCPDS 09-0432 Ký hiệu mẫu HA chuẩn NT Nghiệm thức FT-IR Fourier Transform Infrared Quang phổ hồng ngoại SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét TEM Transmission Electron Kính hiển vi điện tử truyền qua Microscopy XPS X-ray Photoelectron Phổ kế quang điện tử tia X Spectroscopy XRF X-Ray Fluorescence Huỳnh quang tia X XRD X-ray diffraction Nhiễu xạ tia X BET Brunauer–Emmett–Teller Brunauer–Emmett–Teller ICP-MS Inductively coupled plasma mass Hệ thống khối phổ plasma ghép spectrometry cặp cảm ứng PL Postlarvae Tôm hậu ấu trùng AA Amino Acid Axít amin DO Dissoved Oxygen Nồng độ ôxi hòa tan trong nƣớc v
6. TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Tên luận án: Nghiên cứu thu nhận dịch protein thủy phân và hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hƣớng ứng dụng trong thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng. Ngành: Công nghệ chế biến thủy sản. Mã số: 9540105. Khóa: 2015 - 2019 Nghiên cứu sinh: Phạm Viết Nam Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Trang Sĩ Trung 2. PGS.TS. Nguyễn Văn Hòa Cơ sở đào tạo: Trƣờng Đại học Nha Trang Những đóng góp mới của luận án: 1. Luận án đã công bố số liệu về thành phần hóa học của nguồn phế liệu cá Tra (Pangasius hypophthalmus) tại nhà máy chế biến thủy sản Nam Việt thuộc tỉnh An Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. Luận án đã xây dựng đƣợc quy trình thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng gồm dịch protein thủy phân, hydroxyapatite, lipít thô từ phế liệu cá Tra. Khi sử dụng alcalase, sản phẩm dịch protein thủy phân thu đƣợc có độ thủy phân (DH) gần 35%, với hơn 70% khối lƣợng phân tử của dịch thủy phân < 1000 Da, có hàm lƣợng đạm tổng 11,7%, hàm lƣợng lipít tổng 10,8%. Khi sử dụng enzym alcalase và lipase, sản phẩm dịch thủy phân thu nhận có hàm lƣợng đạm tổng 33,2%, hàm lƣợng lipít tổng 1,93%, hàm lƣợng đạm axit amin 420,16 mg/g protein. Hydroxyapatite (HA) thu nhận từ xƣơng cá bằng phƣơng pháp xử lý nhiệt có kích thƣớc 50 – 70 nm, tỷ lệ hàm lƣợng nguyên tố Ca/P là 1,83, diện tích bề mặt của hạt 2,87 m2/g, thể tích lỗ xốp 0,02 m3/g, kích thƣớc lỗ xốp trung bình 1,2 nm và hàm lƣợng kim loại nặng (Pb, Hg, Cd) không phát hiện. Đây là cách tiếp cận mới nhằm sử dụng toàn bộ nguồn phế liệu cá Tra để sản xuất các sản phẩm có giá trị cao, đồng thời hƣớng đến quy trình sản xuất “không- chất-thải”. 3. Luận án đã bƣớc đầu thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung 5% hỗn hợp vào thức ăn, tôm tăng trƣởng 123,5% về khối lƣợng và 112% về chiều dài so với khi không bổ sung. Việc bổ sung hỗn hợp này không ảnh hƣởng đến môi trƣờng nƣớc nuôi tôm. Đây là cơ sở để ứng dụng hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm. vi
7. TM giáo viên hƣớng dẫn Nghiên cứu sinh PGS.TS. Trang Sĩ Trung Phạm Viết Nam vii
8. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN vi DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BẢNG xv PHẦN MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 5 1.1. Cá Tra 5 1.1.1. Giới thiệu chung 5 1.1.2. Phân bố 5 1.1.3. Đặc điểm sinh học của cá Tra 6 1.1.4. Thành phần hóa học và dinh dƣỡng cá Tra 6 1.1.5. Tình hình nuôi, chế biến và xuất khẩu cá Tra 7 1.2. Phế liệu cá Tra 7 1.2.1. Đặc điểm 7 1.2.2. Tận dụng phế liệu cá 8 1.3. Dịch protein thủy phân 10 1.3.1. Sản xuất dịch protein thủy phân 10 1.3.2. Các công bố nghiên cứu sản xuất dịch protein thủy phân 14 1.4. Quá trình thủy phân bằng enzyme 18 1.4.1. Enzyme protease 18 1.4.2. Enzyme alcalase 19 1.4.3. Cơ chế quá trình thủy phân protein 20 1.4.5. Enzyme lipase 20 1.5. Hydroxyapatite (HA - Ca10(PO4)6(OH)2) 21 1.5.1. Tính chất hydroxyapatite 21 1.5.2. Ứng dụng của hydroxyapatite 23 1.5.3. Phƣơng pháp điều chế hydroxyapatite 24 1.5.4. Các nghiên cứu trong nƣớc liên quan đến hydroxyapatite 32 1.6. Tổng quan thức ăn cho tôm hậu ấu trùng 33 viii
9. 1.6.1. Thức ăn cho tôm 33 1.6.2. Yêu cầu thức ăn tôm 34 1.6.3. Thành phần dinh dƣỡng và bổ sung dinh dƣỡng vào thức ăn tôm 36 1.6.3.1.Protein 36 1.6.3.2. Amino axit 36 1.6.3.3.Chất khoáng 37 Chƣơng 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 39 2.1. Nguyên vật liệu 39 2.1.1. Phế liệu cá Tra 39 2.1.2. Enzyme 40 2.1.3. Tôm thẻ chân trắng 40 2.1.4. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu 41 2.1.4.1. Dụng cụ và thiết bị 41 2.1.4.2. Hóa chất sử dụng 43 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 44 2.2.1. Phƣơng pháp tiếp cận nghiên cứu 44 2.2.2. Nghiên cứu xử lý tách lipít trong nguyên liệu 46 2.2.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các thông số đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra bằng enzyme alcalase 48 2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của kích cỡ nguyên liệu đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra 48 2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme alcalase 50 2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân 51 2.2.3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian thủy phân 53 2.2.3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ muối 55 2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các thông số đến quá trình thủy phân dịch protein hòa tan bằng enzyme lipase 57 2.2.4.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme lipase 57 2.2.4.2. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân bằng lipase 58 2.2.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các thông số đến quá trình thu nhận HA từ xƣơng cá Tra thô 60 2.2.5.1. Khảo sát tiền xử lý nguyên liệu thu nhận xƣơng cá Tra khô 60 ix
10. 2.2.5.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ nung 61 2.2.5.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian nung 63 2.2.5.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tốc độ gia nhiệt nung 65 2.2.6. Nghiên cứu thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân (FPH) và hydroxyapatite (HA) vào thức ăn tôm thẻ chân trắng giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. 67 2.3. Phƣơng pháp phân tích 71 2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu 73 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 74 3.1. Nghiên cứu những tính chất của phế liệu cá Tra 74 3.2. Nghiên cứu tách lipít từ phế liệu cá Tra 75 3.3. Nghiên cứu những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân protein trong phế liệu cá Tra bằng enzyme alcalase 77 3.3.1. Ảnh hƣởng của kích cỡ nguyên liệu 78 3.3.2. Ảnh hƣởng hàm lƣợng enzyme alcalase đến quá trình thủy phân 80 3.3.3. Ảnh hƣởng nhiệt độ thủy phân đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra 82 3.3.4. Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra 83 3.3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra 84 3.4. Nghiên cứu những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân dịch thủy phân lipít bằng enzyme lipase 86 3.4.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme lipase 86 3.4.2. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân bằng enzyme lipase 87 3.5. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm protein thủy phân và hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra 88 3.6. Nghiên cứu qui trình sản xuất HA từ phế liệu cá Tra 93 3.6.1. Thành phần hóa học của xƣơng cá Tra thô và sản phẩm HA 93 3.6.2. Kết quả khảo sát tiền xử lý nguyên liệu thu nhận xƣơng cá dạng thô 94 3.6.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nung đến các đặc tính của HA 98 3.6.4. Ảnh hƣởng của thời gian nung đến các đặc tính của HA 103 3.6.5. Ảnh hƣởng của tốc độ nâng nhiệt nung đến HA thu nhận 106 3.6.6. Một số phân tích và so sánh với HA từ nguồn khác 109 3.7. Đề xuất quy trình sản xuất hydroxyapatite dạng nano từ xƣơng cá Tra 117 x
11. 3.8. Nghiên cứu hiệu quả việc thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm thẻ chân trắng 20 – 55 ngày tuổi 118 3.8.1. Ảnh hƣởng của hỗn hợp bổ sung đến các chỉ tiêu hóa lý môi trƣờng nƣớc nuôi 118 3.8.2. Ảnh hƣởng của hỗn hợp bổ sung đến các chỉ tiêu vi sinh vật môi trƣờng nƣớc nuôi tôm 120 3.8.2.1. Tổng số vi khuẩn 120 3.8.2.2. Tổng số vi khuẩn vibrio 121 3.8.3. Ảnh hƣởng của hỗn hợp bổ sung đến tốc độ tăng trƣởng của tôm 122 3.8.3.1. Sự tăng trƣởng về khối lƣợng của tôm thẻ chân trắng (g) 122 3.8.3.2. Sự tăng trƣởng về chiều dài tôm thẻ chân trắng (mm) 123 3.8.3.3. Ảnh hƣởng của hỗn hợp FPH và HA bổ sung vào thức ăn tôm đến tỷ lệ sống và năng suất của tôm 55 ngày tuổi 125 3.8.3.4. Đánh giá chất lƣợng tôm nuôi 55 ngày tuổi 126 3.9. Đề xuất qui trình nuôi tôm thẻ chân trắng 20 – 55 ngày tuổi có bổ sung hỗn hợp dịch FPH và HA từ phế liệu cá Tra. 128 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 129 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHỤ LỤC - 1 - PHỤ LỤC 1 - PHỤ LỤC CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH - 2 - PHỤ LỤC 2 - PHỤ LỤC CÁC SỐ LIỆU - 10 - PHỤ LỤC 3 - PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH -50- xi
12. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cá Tra (Pangasius hypophthalmus). 5 Hình 1.2. Sơ đồ phát triển các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu cá 11 Hình 1.3. Các giai đoạn xúc tác thủy phân bằng enzyme 20 Hình 1.4. Tinh thể HA ở dạng hạt, sợi, que, tấm. 21 Hình 1.5. Ô mạng cơ sở của tinh thể HA. 22 Hình 2.1. Phế liệu cá Tra sau phi-lê. 39 Hình 2.2. Tôm thẻ chân trắng 20 ngày tuổi. 41 Hình 2.3. Sơ đồ phƣơng pháp tiếp cận các vấn đề nghiên cứu của Luận án. 44 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của phƣơng pháp xử lý 46 tách lipít phế liệu cá Tra. 46 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của kích cỡ nguyên liệu đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra. 49 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của hàm lƣợng alcalase đến quá trình thủy phân phế liệu cá Tra. 50 Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân 52 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình 54 thủy phân phế liệu cá Tra. 54 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nồng độ muối đến 56 quá trình thủy phân phế liệu cá Tra. 56 Hình 2.10. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme lipase 57 Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của thời gian thủy phân bằng lipase 59 Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ nung đến quá trình thu nhận HA từ xƣơng cá Tra khô. 62 Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian nung đến HA từ xƣơng cá Tra 64 Hình 2.14. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của tốc độ gia nhiệt HA từ xƣơng cá Tra. 66 xii
13. Hình 2.15. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của hàm lƣợng hỗn hợp dịch FPH và HA bổ sung vào thức ăn tôm. 68 Hình 2.16. Hệ thống bể thí nghiệm nuôi thử nghiệm tôm. 71 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp xử lý nguyên liệu đến DH và NR của dịch protein thủy phân. 76 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của kích cỡ nguyên liệu đến DH và NR của dịch FPH. 79 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng alcalase đến DH và NR của dịch FPH. 81 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến DH và NR của dịch FPH. 82 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến DH và NR của dịch FPH 83 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến DH và NR của dịch FPH. 84 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme lipase đến hàm lƣợng lipít và NR. 86 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hàm lƣợng lipít và NR 88 Hình 3.9. Sơ đồ quy trình sản xuất dịch protein thủy phân bằng enzyme alcalase và lipase thƣơng mại từ phế liệu cá Tra. 89 Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn phân bố khối lƣợng phân tử của dịch thủy phân. 90 Hình 3.11. Hình ảnh dịch FPH cô đặc từ phế liệu cá Tra thủy phân bằng enzyme alcalase và lipase. 92 Hình 3.12. Hình ảnh xƣơng cá Tra thu đƣợc theo (a) phƣơng pháp đun sôi và (b) phƣơng pháp thủy phân bằng alcalase. 95 Hình 3.13. Ảnh SEM của HA thu đƣợc từ xƣơng cá Tra nung ở (a) 600oC, (b) 700oC, (c) 800oC, (d) 900oC và (e) 1000oC. 99 Hình 3.14. Ảnh TEM của HA thu đƣợc từ xƣơng cá Tra nung ở (a) 600oC, (b) 700oC, (c) 800oC, (d) 900oC và (e) 1000oC. 100 Hình 3.15. Phổ XRD của (a) xƣơng cá Tra, HA (b) 600oC, (c) 700oC, (d) 800oC, 101 Hình 3.16. Phổ FTIR (a) xƣơng cá Tra, HA (b) 700oC và (c) 900oC trong 2 giờ. 103 Hình 3.17. HA thu nhận từ xƣơng cá Tra ở mẫu 1 (1 giờ), mẫu 2 (2 giờ), mẫu 3 (3 giờ), mẫu 4 (4 giờ), mẫu 5 (5 giờ). 104 Hình 3.18. Ảnh SEM của HA thu đƣợc từ xƣơng cá Tra nung ở (a) 1 giờ, (b) 2 giờ, (c) 3 giờ, (d) 4 giờ và (e) 5 giờ. 105 Hình 3.19. Phổ XRD của HA thu đƣợc ở các thời gian nung (a) 1 giờ, (b) 2 giờ, (c) 3 giờ, (d) 4 giờ và (e) 5 giờ 106 xiii
14. Hình 3.20. HA cá Tra thu nhận ở các tốc độ gia nhiệt nung, mẫu 1 (3oC/phút), mẫu 2 (50C/phút), mẫu 3 (7oC/phút) và mẫu 4 (10oC/phút). 107 Hình 3.21. Ảnh SEM của HA thu đƣợc từ xƣơng cá Tra nung ở tốc độ gia nhiệt 108 Hình 3.22. Phổ XRD của (a) xƣơng cá thô và HA thu đƣợc ở các tốc độ gia nhiệt 108 Hình 3.23. Ảnh SEM của HA thu đƣợc ở 700oC từ xƣơng (a) cá Tra, (b) cá Rô phi, (c) cá Chẽm và (d) cá Ngừ 110 Hình 3.24. Ảnh TEM của HA thu đƣợc ở 700oC từ xƣơng (a) cá Tra, (b) cá Rô phi, (c) cá Chẽm và (d) cá Ngừ. 110 Hình 3.25. Ảnh (a,b) TEM, (c) HRTEM và (d) mẫu SAED của HA thu đƣợc từ xƣơng cá Tra ở 700oC với các độ phóng đại khác nhau. 111 Hình 3.26. Phổ XRD của xƣơng (a) cá Tra, (b) cá Rô phi, (c) cá Chẽm, (d) cá Ngừ và HA chuẩn JCPDS-09-0432 111 Hình 3.27. (a) Phổ XPS tổng của HA và phổ XPS phân giải cao của (b) Ca 2p, (c) P 2p và (d) O 1s. 114 Hình 3.28. Đồ thị hấp và giải hấp của HA thu đƣợc từ xƣơng (a) cá Tra, (b) cá Rô phi, (c) cá Chẽm, (d) cá Ngừ. 116 Hình 3.29. Sơ đồ quy trình thu nhận hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra. 117 Hình 3.28. Đồ thị tăng trƣởng của tôm thẻ chân trắng theo khối lƣợng tôm của 5 nghiệm thức nuôi tôm 123 Hình 3.29. Đồ thị tăng trƣởng tôm thẻ chân trắng theo chiều dài 5 nghiệm thức. 124 Hình 3.30. Tôm thẻ chân trắng 27 ngày tuổi của 5 nghiệm thức (a) NT1, (b) NT2, (c) NT3, (d) NT4 và (e) NT5. 125 Hình 3.31. Tôm thẻ chân trắng ở các giai đoạn (a) 20 ngày tuổi, (b) 27 ngày tuổi, (c) 34 ngày tuổi, (d) 41 ngày tuổi và (e) 55 ngày tuổi. 125 Hình 3.32. Ảnh SEM với độ phóng đại khác nhau của vỏ tôm thẻ chân trắng post 55 (a,b) nghiệm thức 1, (c,d) nghiệm thức 4. 127 Hình 3.33. Phổ XRD vỏ tôm 55 ngày tuổi (a) nghiệm thức 1, (b) nghiệm thức 4. 127 Hình 3.34. Qui trình nuôi tôm thẻ chân trắng 20 – 55 ngày tuổi có bổ sung hỗn hợp dịch FPH và HA từ phế liệu cá Tra 128 xiv
15. DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng của cá Tra 6 Bảng 1.2. Thành phần phần trăm khối lƣợng cá Tra 7 Bảng 1.3. Thành phần hóa học của phế liệu một số loài cá (wt%) 8 Bảng 1.4. Các phƣơng pháp hóa học tổng hợp HA 26 Bảng 1.5. HA thu nhận từ phế liệu cá và ứng dụng 31 Bảng 1.6. Sản lƣợng bột cá nhập khẩu của Việt Nam từ 2008-2016 34 Bảng 1.7. Chỉ tiêu lý, hóa của thức ăn tôm 35 Bảng 1.8. Thành phần axit amin trong thức ăn tôm có hàm lƣợng protein 35% . 37 Bảng 2.1. Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong quá trình nghiên cứu. 41 Bảng 2.2. Một số vật tƣ hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu. 43 Bảng 3.1. Thành phần khối lƣợng và hóa học của phế liệu cá Tra 74 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của các phƣơng pháp tách lipít phế liệu cá Tra 75 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của kích cỡ nguyên liệu đến DH và NR của dịch FPH 78 Bảng 3.4. Thông số chất lƣợng của dịch FPH từ phế liệu cá Tra 91 Bảng 3.5. Thành phần axít amin của dịch FPH từ phế liệu cá Tra 91 Bảng 3.6. Thành phần axít béo của dầu cá thô thu nhận từ phế liệu cá Tra thủy phân 93 Bảng 3.7. Thành phần hóa học của xƣơng cá Tra thô 96 Bảng 3.8. Thành phần hóa học của sản phẩm HA 96 Bảng 3.9. Thành phần hóa học của phế liệu từ các loại cá khác nhau 97 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất và trạng thái của HA xƣơng cá Tra 98 Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của thời gian nung đến tính chất sản phẩm HA 104 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của tốc độ gia nhiệt nung đến tính chất sản phẩm HA 107 Bảng 3.13. Thành phần nguyên tố của HA xƣơng cá 112 Bảng 3.14. Kết quả thành phần nguyên tố của HA từ xƣơng cá thô 115 Bảng 3.15. Thành phần ôxít kim loại của HA từ xƣơng cá thô. 115 Bảng 3.16. Diện tích bề mặt của HA từ xƣơng cá Tra và một số loại cá khác 116 Bảng 3.17. Các chỉ tiêu môi trƣờng của các nghiệm thức nuôi tôm 119 Bảng 3.18. Mật độ tổng vi khuẩn trong môi trƣờng nƣớc ở các nghiệm thức (CFU/mL) Đơn vị tính: 103 CFU/mL 120 xv
16. Bảng 3.19. Mật độ tổng vi khuẩn vibrio trong môi trƣờng nƣớc các nghiệm thức (CFU/mL) Đơn vị tính: 103 CFU/mL 121 Bảng 3.20. Khối lƣợng và chiều dài tôm ở các giai đoạn nuôi thử nghiệm 126 Bảng 3.21. Tỷ lệ sống và năng suất của tôm 55 ngày tuổi ở các nghiệm thức 125 xvi
17. PHẦN MỞ ĐẦU Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong hai sản phẩm thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Tổng diện tích nuôi cá Tra của Việt Nam tăng nhanh từ năm 2015 là 5.500 ha lên 7.127 ha năm 2019 tƣơng ứng với sản lƣợng cá Tra thu hoạch đạt 1 triệu tấn tăng lên 1,52 triệu tấn. Tổng giá trị xuất khẩu tăng từ 1,57 tỷ USD năm 2015 lên đạt 2 tỷ USD năm 2019, đóng góp 23,26% vào giá trị xuất khẩu của ngành Thủy sản [14]. Hầu hết các sản phẩm cá Tra xuất khẩu dƣới dạng cá Tra phi-lê đông lạnh. Tuy nhiên, khối lƣợng cá Tra phi-lê chỉ chiếm khoảng 40%, do đó khoảng 60% là phế liệu cá gồm đầu, vây, khung xƣơng, nội tạng, da, thịt vụn [86,93,103,138]. Đây là nguồn phế liệu khổng lồ, rất có tiềm năng để sản xuất các giá phẩm giá trị gia tăng nhƣng nếu không có cách giải quyết phù hợp thì sẽ gây lãng phí tài nguyên và ô nhiễm môi trƣờng. Ở nƣớc ta hiện nay, phế liệu cá Tra lớn thải ra từ các dây chuyền chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh tại các nhà máy chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh tại một số tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, nhƣ: Nam Việt, Vĩnh Hoàn, Hùng Cá chủ yếu vẫn đƣợc dùng để sản xuất bột cá với công nghệ đơn giản nhƣ hấp, sấy và nghiền. Sản phẩm này thƣờng dùng làm thức ăn chăn nuôi có giá trị kinh tế và chất lƣợng thấp. Trong khi đó, phế liệu cá có chứa nhiều hợp chất có giá trị dinh dƣỡng và kinh tế cao nhƣ protein, khoáng, lipít, . [35,39,58,74,86]. Các hợp chất này có thể đƣợc dùng để sản xuất ra các sản phẩm thức ăn có giá trị kinh tế cao dùng trong chăn nuôi, thậm chí có thể sử dụng làm thực phẩm cho con ngƣời [86,103,138]. Do đó, việc nghiên cứu thu nhận các hợp chất có giá trị gia tăng từ phế liệu cá Tra là rất cần thiết. Các tài liệu đã công bố cho thấy các hợp chất sinh học (dịch thủy phân protein, lipít, axit amin, khoáng ) có thể đƣợc thu nhận từ phế liệu cá chủ yếu bằng hai cách chính đó là phƣơng pháp dùng các tác nhân hóa học [35,49,58,77,99,154] và phƣơng pháp sử dụng tác nhân sinh học [74,128,136,144]. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phế liệu cá bằng phƣơng pháp khác nhau. Tuy vậy, các công trình này thƣờng chỉ sử dụng một phần trong phế liệu cá để thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng. Cụ thể, một số tác giả tập trung thu nhận dịch thủy phân protein và lipít từ phần hữa cơ của phế liệu cá mà bỏ qua phần khoáng chất (chủ yếu hydroxyapatite, HA) từ 1
18. phần xƣơng cá [68,77,119,157]. Ngƣợc lại, một số tác giả chỉ thu nhận HA từ xƣơng cá [48,79,140,155], bỏ qua phần protein và lipít có trong phế liệu cá. Việc sử dụng một phần phế liệu cá vừa gây lãng phí tài nguyên, vừa có khả năng gây ô nhiễm môi trƣờng hoặc phát sinh chi phí xử lý chất thải. Từ các nhận định trên, tác giả đề xuất “Nghiên cứu thu nhận dịch protein thủy phân và hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra, định hướng ứng dụng trong thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng”. Đề tài định hƣớng thu nhận đồng thời các sản phẩm giá trị gia tăng nhƣ dịch thủy phân protein, hydroxyapatite, lipít từ phế liệu cá Tra và thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và HA vào thức ăn tôm thẻ chân trắng. Kết quả của đề tài sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế của sản phẩm cá Tra Việt Nam, giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng, đồng thời cung cấp thêm nguồn dinh dƣỡng cho thức ăn tôm. Mục tiêu nghiên cứu tổng quát: Xây dựng đƣợc quy trình thu nhận đồng thời dịch protein thủy phân, hydroxyapatite và lipít thô từ phế liệu cá Tra sau phi-lê bằng enzyme alcalase và lipase. Ứng dụng thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. Mục tiêu nghiên cứu cụ thể: Để đạt đƣợc mục tiêu nghiên cứu tổng quát trên đề tài xác định các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: 1. Nghiên cứu xây dựng đƣợc quy trình sản xuất dịch protein thủy phân từ phế liệu cá Tra bằng phƣơng pháp sinh học. Sản phẩm dịch protein thủy phân có hàm lƣợng protein và hàm lƣợng lipít đạt TCVN-10325: 2014 để ứng dụng bổ sung vào thức ăn tôm 20 – 55 ngày tuổi. 2. Nghiên cứu xây dựng đƣợc quy trình thu nhận hydroxyapatite (HA) từ xƣơng cá Tra bằng phƣơng pháp nhiệt. Sản phẩm HA có kích thƣớc nano, có độ xốp và độ tinh khiết và phù hợp làm nguồn khoáng bổ sung vào thức ăn tôm 20 – 55 ngày tuổi. 3. Xác định đƣợc hàm lƣợng thích hợp của hỗn hợp dịch protein thủy phân và HA bổ sung vào thức ăn tôm 20 – 55 ngày tuổi trong điều kiện thử nghiệm để thúc đẩy nhanh quá trình tăng trƣởng của tôm. Nội dung nghiên cứu Để đạt đƣợc 3 mục tiêu nghiên cứu trên, luận án tập trung nghiên cứu 3 nội dung: 2
19. 1. Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân phế liệu cá Tra đạt độ thủy phân và hiệu suất thu hồi nitơ cao nhất theo 2 giai đoạn, gồm: Giai đoạn 1: nguyên liệu phế liệu cá Tra, hàm lƣợng enzyme alcalase, nhiệt độ, thời gian thủy phân và nồng độ muối bổ sung. Giai đoạn 2: hàm lƣợng enzyme lipase và thời gian thủy phân. 2. Nghiên cứu xác định các thông số thích hợp cho quá trình thu nhận hydroxyapatite có kích thƣớc nano từ xƣơng cá Tra gồm: phƣơng pháp tiền xử lý nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian nung và tốc độ gia nhiệt nung. 3. Thử nghiệm xác định hàm lƣợng hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite thích hợp bổ sung vào thức ăn tôm thẻ chân trắng 20 – 55 ngày tuổi để đánh giá khả năng tăng trƣởng của tôm, tác động của môi trƣờng nuôi tôm so với chỉ sử dụng thức ăn tôm thƣơng mại. Phạm vi nghiên cứu: Luận án nghiên cứu thu nhận dịch protein thủy phân, hydroxyapatite và lipít thô từ phế liệu cá Tra bằng enzyme alcalase và lipase. Ứng dụng thử nghiệm bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn nuôi tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án: - Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của Luận án cung cấp thông tin về thành phần hóa học của nguồn phế liệu cá Tra (Pangasius hypophthalmus) với các kích cỡ cá nguyên liệu khác nhau. Từ đó, lƣu chọn quy trình phù hợp để xử lý phế liệu hiệu quả. Ngoài ra, Luận án trình bày quy trình thu nhận đồng thời các sản phẩm giá trị gia tăng gồm dịch protein thủy phân, hydroxyapatite, lipít thô hƣớng đến quy trình sản xuất “không-chất-thải”. Kết quả bƣớc đầu về bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi để làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo. Đây là tài liệu tham khảo cho sinh viên, giảng viên và các cán bộ nghiên cứu khoa học về hƣớng nghiên cứu liên quan. - Ý nghĩa thực tiễn: Việc tận dụng phế liệu cá Tra sau quá trình chế biến để thu nhận đồng thời các sản phẩm giá trị gia tăng gồm dịch protein thủy phân, hydroxyapatite, lipít thô hƣớng đến quy trình sản xuất “không-chất-thải” và tận dụng bổ sung hỗn hợp dịch protein thủy 3
20. phân và hydroxyapatite vào thức ăn tôm giai đoạn 20 – 55 ngày tuổi sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế của sản phẩm cá Tra Việt Nam, mang lại lợi ích to lớn cho các doanh nghiệp chế biến thủy sản, đem lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời làm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng do nguồn phế phẩm gây ra. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu gợi mở cho sản xuất và sử dụng hỗn hợp dịch thủy phân và hydroxyapatite từ phế liệu cá Tra bổ sung vào thức ăn nuôi tôm. 4
21. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Cá Tra 1.1.1. Giới thiệu chung Tên tiếng Anh: Shutchi Catfish Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878) Tên thƣơng mại: Tra catfish Bộ cá nheo: Siluriformes Họ cá Tra: Pangasiidae Giống cá Tra dầu: Pangasianodon Loài cá Tra: Pangasianodon hypophthalmus Cá Tra là một trong số 11 loài thuộc họ cá Tra (Pangasiidae) đã đƣợc xác định ở sông Cửu Long. Hình 1.1. Cá Tra (Pangasius hypophthalmus). 1.1.2. Phân bố Cá Tra phân bố chủ yếu ở lƣu vực sông Mê Kông, đặc biệt ở 4 nƣớc Lào, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam. Ở Việt Nam, cá Tra không sinh sản trong ao nuôi và ngoài tự nhiên. Cá Tra sinh sản ở vùng Campuchia, cá Tra bột theo dòng nƣớc sông Mê Kông về Việt Nam. Hiện nay, Việt Nam đã sinh sản nhân tạo thành công giống cá Tra và đã cung cấp đƣợc nhu cầu về giống cho nghề nuôi cá Tra thƣơng phẩm. Cá trƣởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, ít gặp trong tự nhiên, do cá có tập tính di cƣ ngƣợc dòng sông Mê Kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Khảo sát 5
22. chu kỳ di cƣ của cá Tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngƣợc dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cƣ về hạ lƣu từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm. 1.1.3. Đặc điểm sinh học của cá Tra Cá Tra là cá da trơn, cá có thân dài, dẹp ngang, lƣng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, đầu nhỏ vừa phải, mắt tƣơng đối to, có 2 râu dài; vây lƣng cao, có một gai cứng có răng cƣa; vây ngực có ngạnh, bụng có 8 tia phân nhánh, trong khi các loài khác có 6 tia [6]. Cá Tra có thể sống đƣợc trong điều kiện ao tù nƣớc đọng, nhiều chất hữu cơ, oxy hòa tan thấp, mật độ nuôi cao bởi vì cá Tra có cơ quan hô hấp phụ và còn có thể hô hấp bằng bóng khí và da. Cá Tra có thể sống đƣợc ở vùng nƣớc có nồng độ muối 7 - 10‰ và nƣớc phèn có pH ≥ 5; cá dễ chết ở nhiệt độ thấp ≤ 15oC nhƣng chịu nóng lên đến 39oC. 1.1.4. Thành phần hóa học và dinh dƣỡng cá Tra Thành phần hóa học và dinh dƣỡng của cá Tra đƣợc trình bày ở Bảng 1.1. Thành phần hóa học của cá Tra chủ yếu gồm: nƣớc, protein, lipít, muối vô cơ, vitamin và phụ thuộc vào giống, loài, giới tính Ngoài ra, thành phần hóa học còn phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ: thức ăn, môi trƣờng sống, kích cỡ cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hƣởng đến thành phần hóa học của cá nguyên liệu, đặc biệt là nguyên liệu cá nuôi [2]. Bảng 1.1. Thành phần dinh dƣỡng của cá Tra [2] Thành phần Giá trị Năng lƣợng cung cấp/100g 124,52 cal Năng lƣợng cung cấp từ chất béo 30,84 cal Tổng lƣợng chất béo 3,42 g Chất béo bão hòa 1,64 g Chất béo chƣa bão hòa (có DHA, EPA) 1,78 g Cholesterol 25,2 mg Na 70,6 mg Protein 23,42g Bảng 1.1 cho thấy rằng hàm lƣợng protein trong cá Tra vào khoảng 23,42% tƣơng đối cao. Trong thịt cá Tra còn chứa nhiều DHA, hàm lƣợng cholesterol rất thấp (0,025%) nên thịt cá Tra rất tốt cho não bộ, tốt cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Thành phần khối lƣợng của cá Tra phụ thuộc vào loài, giống, tuổi tác, giới tính, thức ăn và khu vực sinh sống. 6
23. Bảng 1.2. Thành phần phần trăm khối lƣợng cá Tra [2] Bộ phận Hàm lƣợng (%) Thịt cá 33 – 38 Xƣơng, đầu vây 27 – 42 Mỡ 15 – 24 Da 5 – 7 Tỉ lệ thành phần khối lƣợng cá Tra còn thay đổi theo trọng lƣợng cá, cá càng lớn thì tỉ lệ thịt càng nhiều hơn so với các thành phần khác [2]. 1.1.5. Tình hình nuôi, chế biến và xuất khẩu cá Tra Ở Việt Nam, Cá Tra đƣợc nuôi chủ yếu ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long nhƣ An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre. Tổng diện tích nuôi cá Tra của Việt Nam tăng nhanh từ năm 2015 là 5.500 ha lên 7.127 ha năm 2019 tƣơng ứng với sản lƣợng cá Tra thu hoạch đạt 1 triệu tấn tăng lên 1,52 triệu tấn. Tổng giá trị xuất khẩu tăng từ 1,57 tỷ USD năm 2015 lên đạt 2 tỷ USD năm 2019, đóng góp 23,26% vào giá trị xuất khẩu của ngành Thủy sản [15]. Tại vùng đồng bằng sông Cửu Long, các tỉnh có diện tích nuôi lớn đạt sản lƣợng cá Tra tăng mạnh là Đồng Tháp với 466,3 nghìn tấn, tăng 6,0%, An Giang 261,6 nghìn tấn (+5,9%), Cần Thơ đạt 174,2 nghìn tấn (+6,4%). 1.2. Phế liệu cá Tra 1.2.1. Đặc điểm Cá Tra là một trong hai sản phẩm chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành chế biến thủy sản Việt Nam sau sản phẩm tôm. Ngành công nghiệp chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh tạo ra một lƣợng lớn đầu, xƣơng, mỡ, nội tạng và da cá Tra. Phế liệu của cá Tra sau khi phi lê, bỏ da chiếm khoảng 60% so với nguyên liệu cá. Phế liệu cá có chứa hàm lƣợng lipít cao khoảng 14,6 – 17,5%. Theo ƣớc tính, nếu sản lƣợng cá Tra nguyên liệu đạt một triệu tấn/năm thì các doanh nghiệp phải loại bỏ hơn 600.000 tấn phế liệu. Do vậy, việc tận dụng thu nhận các sản phẩm có giá trị cao hơn góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của công nghiệp chế biến cá Tra phi-lê đông lạnh nhằm tránh lãng phí tài nguyên và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng. Phế liệu cá Tra trong các nhà máy chế biến bao gồm: đầu, xƣơng, vây, nội tạng, máu, mỡ, thịt vụn cá phụ thuộc mùa vụ của nguồn nguyên liệu và mang đặc trƣng theo từng loại hình công nghệ chế biến khác nhau. Khối lƣợng và chủng loại 7