Luận án Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học của Lipid trong một số loài rong biển ở Việt Nam

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học của Lipid trong một số loài rong biển ở Việt Nam

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  PHẠM THU HUẾ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LIPID TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG BIỂN Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội- 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  PHẠM THU HUẾ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LIPID TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG BIỂN Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số: 9.44.01.17 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trần Thị Thanh Vân 2. TS. Lê Tất Thành Hà Nội- 2021
3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và các cộng sự. Các kết quả nghiên cứu không trùng lặp và chưa từng công bố trong tài liệu khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Phạm Thu Huế
4. ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Thị Thanh Vân và TS. Lê Tất Thành đã định hướng khoa học, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin gửi đến Cô và Thầy những lời biết ơn chân thành nhất. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của GS.TS Phạm Quốc Long, các anh chị và các bạn trong Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Trung tâm Khoa học Quốc gia về sinh vật biển - Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Học viện Hải Quân và Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án. Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Luận án không tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của hội đồng và các Thầy Cô để luận án của NCS được hoàn thiện hơn. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Phạm Thu Huế
5. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN Error! Bookmark not defined. MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về rong biển 3 1.1.1. Giới thiệu chung 3 1.1.2. Đa dạng loài và phân bố rong biển ở Việt Nam 4 1.1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của rong biển 6 1.2. Lipid rong biển 14 1.2.1. Khái niệm chung về lipid 14 1.2.2. Các lớp chất của lipid 16 1.2.2.1. Hydrocacbon và sáp 17 1.2.2.2. Triacylglycerol, diacylglycerol, monoankyldiacylglycerol 17 1.2.2.3. Sterol 17 1.2.2.4. Các axit béo 18 1.2.2.5. Lipid phân cực 21 1.2.3. Các nghiên cứu trên thế giới và trong nước về lipid rong biển 23 1.3. Phổ khối phân giải cao trong nghiên cứu lipid phân cực 29 1.3.1. Hệ thống thiết bị LCMS-IT-TOF 29 1.3.1.1 Kỹ thuật khối tứ cực 29 1.3.1.3. Kĩ thuật thời gian bay (Time of Flight - TOF) 30 1.3.2. Ứng dụng LCMS-IT-TOF trong nghiên cứu lipid phân cực 31 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu 33 2.2. Phương pháp nghiên cứu 39 2.2.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu 39
6. iv 2.2.2. Phương pháp phân lập, chiết tách lipid, axit béo 39 2.2.2.1. Phương pháp chiết tách và xác định hàm lượng lipid tổng 39 2.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng 39 2.2.2.3. Phương pháp phân tích thành phần và hàm lượng các axit béo 40 2.2.3. Phương pháp phân tích cấu tử chính 40 2.2.4. Phương pháp xác định các dạng phân tử lipid phân cực 40 2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 41 2.2.5.1. Hoạt tính bẫy gốc tự do 41 2.2.5.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 41 2.2.5.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 42 2.2.5.4. Hoạt tính kháng viêm 42 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 43 3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipid tổng 43 3.2. Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo 44 3.3. Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng 44 3.4. Xác định các dạng phân tử lipid phân cực 45 3.4.1. Xác định các nhóm chất trong từng phân lớp lipid phân cực 46 3.4.2. Xác định các dạng phân tử của phân lớp phospholipid 46 3.4.2.1. Dạng phân tử phosphatic acid (PA) 46 3.4.2.2. Dạng phân tử phosphatidylglycerol (PG) 47 3.4.2.3. Dạng phân tử phosphatidylcholine (PC) 49 3.4.2.4. Dạng phosphatidyl inositol (PI) 51 3.4.3. Xác định các dạng phân tử của phân lớp glycolipid 53 3.4.3.1. Dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) 53 3.4.3.2. Dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol (DGDG) 55 3.4.3.3. Dạng phân tử sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) 57 3.4.4. Xác định các dạng phân tử của phân lớp betaine lipid 60 3.4.4.1. Dạng phân tử diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine (DGTS) . 60 3.4.4.2. Dạng phân tử diaclyglycerylhydroxymethyl-N,N,N-trimethyl-beta- alanine (DGTA) 64 3.5. Xác định hoạt tính sinh học của các phân đoạn lipid 67
7. v 3.5.1. Hoạt tính bẫy gốc tự do 67 3.5.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 68 3.5.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 69 3.5.4. Hoạt tính kháng viêm 70 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 4.1. Nghiên cứu sàng lọc lipid và axit béo của rong biển 73 4.1.1. Hàm lượng lipid tổng và các lớp chất lipid 73 4.1.2. Thành phần và hàm lượng các axit béo 80 4.1.2.1. Thành phần và hàm lượng các axit béo của ngành rong Đỏ 80 4.1.2.2. Thành phần và hàm lượng các axit béo của ngành rong Nâu 83 4.1.2.3. Thành phần và hàm lượng các axit béo của ngành rong Lục 85 4.1.3. Ứng dụng dữ liệu axit béo trong phân loại hoá học (Chemotaxonomy) đối với các ngành rong biển Việt Nam 88 4.2. Xác định các dạng phân tử lipid phân cực của rong Nâu Lobophora sp. 93 4.2.1. Xác định các dạng phân tử phospholipid 93 4.2.1.1. Xác định các dạng phân tử phosphatic acid 93 4.2.1.2. Xác định các dạng phân tử phosphatidylglycerol 94 4.2.1.3. Xác định các dạng phân tử phosphatidylcholine 97 4.2.1.4. Xác định các dạng phân tử phosphatidyl inositol 99 4.2.2. Xác định các dạng phân tử glycolipid 101 4.2.2.1. Xác định các dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol 101 4.2.2.2. Xác định các dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol 103 4.2.2.3. Xác định các dạng phân tử sulfoquinovosyl diacylglycerol 104 4.2.3. Xác định các dạng phân tử betaine lipid 107 4.2.3.1. Xác định các dạng phân tử diacylglyceryl-N,N,N- trimethylhomoserine 107 4.2.3.2. Xác định các dạng phân tử diaclyglycerylhydroxymethyl-N,N,N- trimethyl-beta-alanine 109 4.3. Xác định các dạng phân tử lipid phân cực của rong Lục Halimeda incrasata Lamx. 113 4.3.1. Xác định các dạng phân tử phospholipid 113 4.3.1.1. Xác định dạng phân tử phosphatidylglycerol 113
8. vi 4.3.1.2. Xác định dạng phân tử phosphatidyl inositol 116 4.3.2. Xác định các dạng phân tử glycolipid 118 4.3.2.1. Xác định dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol 118 4.3.2.2. Xác định dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol 119 4.3.2.3. Xác định dạng phân tử sulfoquinovosyl diacylglycerol 122 4.3.3. Xác định các dạng phân tử betaine lipid 123 4.4. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học 128 4.4.1. Hoạt tính bẫy gốc tự do 128 4.4.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 128 4.4.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư 129 4.4.4. Hoạt tính kháng viêm 131 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 133 1. KẾT LUẬN 133 2. KIẾN NGHỊ 134 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 135 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ 136 TÀI LIỆU THAM KHẢO 137 PHỤ LỤC 151
9. vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 1. AA Axit arachidonic 2. ABTS 2,2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) 3. APCI Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển 4. APPI Ion hóa bằng proton tại áp suất khí quyển 5. BHT Butylated Hydroxy Toluene 6. CC Sắc kí cột 7. CI Ion hóa hóa học 8. COX Cyclooxygenase 9. DG Diacylglycerol 10. DGDG Diglycosyldiacylglycerol 11. DGTA Diaclyglycerylhydroxymethyl-N,N,N-trimethyl- alanine 12. DGTS Diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine 13. DHA Docosahexaenoic acid 14. DMSO Dimethyl Sulfoxide 15. DPA Docosapentaenoic acid 16. DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 17. EI Ion hóa electron 18. EPA Eicosapentaenoic acid 19. ESI Ion hóa phun mù điện tử 20. FAB Bắn phá nguyên tử nhanh 21. FBS Fetal bovine serum (huyết thanh phôi bò) 22. FD Giải hấp trường 23. FFA Axit béo tự do 24. FI Ion hóa trường 25. FRAP Ferric reducing antioxidant power 26. FT ICR Ion hóa cộng hưởng ion cyclotron biến đổi Fourier 27. FTC Ferric thiocyanate 28. GC Sắc ký khí 29. GC-MS Sắc ký khí khối phổ
10. viii 30. GF-GC Sắc kí rây phân tử 31. HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao 32. HRMS Phổ khối phân giải cao 33. HW Hidrocabon và sáp 34. IC50 Inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%) 35. IL Interleukin 36. IT Bẫy ion 37. LB Luria bertani (môi trường nuôi cấy vi sinh) 38. LC Sắc ký lỏng 39. LCMS Sắc ký lỏng khối phổ 40. LPS Lipopolysacarit 41. MADG Monoalkyldiacylglycerol Matrix-assisted laser desorption ionization (Phương pháp ion 42. MALDI hóa mẫu hấp thụ dựa trên sự hỗ trợ của các chất nền và năng lượng laser) 43. MGDG Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), 44. MGTS Monoacylglyceryl -N, N, N- trimethyl homoserine 45. MRM Quét một hoặc nhiều phản ứng đã chọn 46. MS Phổ khối 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)- 47. MTS 2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium 48. MTT 3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazol brom 49. NF-κB Yếu tố nhân kappa B 50. NP-GC Hấp phụ pha thường 51. NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory drugs 52. NPL Neutral porlar lipid (lipid trung tính) 53. OD Optical Density (Mật độ quang học) 54. PA Phosphatidic acid 55. PC Phosphatidylcholine 56. PE Phosphatidylethanolamine 57. PG Phosphatidylglycerol 58. PI Phosphatidylinositol
11. ix 59. PL Phospholipid 60. Pol Polar Lipid (Lipid phân cực) 61. PS Phosphatidylserine 62. PUFA Polyunsaturated fatty acids (axit béo không no đa nối đôi) 63. Q Khối tứ cực 64. ROS Reactive oxygen spieces 65. Rt Retention Time (thời gian lưu) 66. RP-GC Hấp phụ pha đảo Roswell park memorial instituter (môi trường nuôi cấy tế 67. RPMI bào) 68. SC Scavenging capacity (trung hòa các gốc tự do) 69. SQDG Sulfoquinovosyldiacylglycerol 70. SRB Sulforhodamine B 71. ST Sterol 72. TCA Trichloracetic acid 73. TG Triacylglycerol 74. TL Total Lipid (Lipid tổng) 75. TLC Sắc kí lớp mỏng 76. TNF-α Tumor Necrosis Factor-α 77. TOF Khối phổ kế thời gian bay 78. TPTZ 2,4,6-tripyridyl-s-triazine 79. UHPLC Sắc kí lỏng siêu áp
12. x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tên gọi của một số axit béo thường gặp trong lipid rong biển. 18 Bảng 2.1. Danh sách 60 mẫu rong biển 34 Bảng 3.1. Khoảng thời gian lưu của các nhóm chất 46 Bảng 4.1. Hàm lượng lipid tổng (% khối lượng tươi) và các lớp chất lipid (% tổng các lớp chất) 73 Bảng 4.2. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung hàm lượng lipid tổng của 60 mẫu rong biển nghiên cứu 76 Bảng 4.3. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung các lớp chất lipid của 60 mẫu rong biển nghiên cứu 77 Bảng 4.4. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung các axit béo 81 Bảng 4.5. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung các axit béo 83 Bảng 4.6. Giá trị các tham số đo lường xu hướng tập trung các axit béo 86 Bảng 4.7. Ma trận tương quan của 14 axit béo của 50 mẫu rong biển nghiên cứu 89 Bảng 4.8. Các dạng phân tử phosphatidic acid (PA) 93 Bảng 4.9. Các dạng phân tử phosphatidylglycerol (PG) 95 Bảng 4.10. Các dạng phân tử phosphatidylcholine (PC) 97 Bảng 4.11. Các dạng phân tử phosphatidylinositol (PI) 99 Bảng 4.12. Các dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) 101 Bảng 4.13. Các dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol (DGDG) 103 Bảng 4.14. Các dạng phân tử sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) 105 Bảng 4.15. Các dạng phân tử diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine (DGTS) 108 Bảng 4.16. Các dạng phân tử diaclyglycerylhydroxymethyl-trimethylalanine (DGTA) 110 Bảng 4.17. Các dạng phân tử phosphatidylglycerol (PG) 114 Bảng 4.18. Các dạng phân tử phosphatidylinositol (PI) 116 Bảng 4.19. Các dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) 118 Bảng 4.20. Các dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol (DGDG) 120 Bảng 4.21. Các dạng phân tử sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) 122
13. xi Bảng 4.22. Các dạng phân tử diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine (DGTS) 124 Bảng 4.23. Kết quả đánh giá hoạt tính bẫy gốc tự do 128 Bảng 4.24. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 129 Bảng 4.25. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào 130 Bảng 4.26. Kết quả xác định hoạt tính kháng viêm 131
14. xii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu tạo hóa học của một số hợp chất polysaccharide 7 Hình 1.2. 22 hợp chất được tách từ loài rong Lobophora variegata 9 Hình 1.3. Các hợp chất có hoạt tính chống ung thư trong một số loài rong biển 12 Hình 1.4. Cấu tạo phân tử lipid 15 Hình 1.5. Cấu tạo lipid trên cơ sở glyxerin 15 Hình 1.6. Cấu tạo lipid trên cơ sở sphingozin 16 Hình 1.7. Cấu tạo của một số glycolipid đặc trưng 21 Hình 1.8. Sơ đồ cấu tạo của phospholipid 22 Hình 1.9. Dạng cấu tạo của betaine lipid 23 Hình 1.10. Cấu tạo khối phổ bẫy ion (QIT) và thời gian bay (TOF) 31 Hình 1.11. Quá trình đo MSn 31 Hình 1.12. Cửa sổ lưu đồ tổng 32 Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu 33 Hình 2.2. Ảnh 9 mẫu rong biển tiêu biểu 38 Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu chung. 43 Hình 3.2. Khoảng thời gian lưu của các nhóm chất khi sử dụng cột Diol 46 Hình 4.1. Bản mỏng, sắc kí đồ và ảnh 2 loài rong biển chọn lọc 79 Hình 4.2. Biểu diễn phân tích PCA của 50 mẫu rong biển trên mặt phẳng 2 chiều . 90 - Hình 4.3. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PA 40:8 [C43H68O8P] . 94 - Hình 4.4. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PG 34:2 [C40H74O10P] . 96 Hình 4.5. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PC 30:0 [C38H76NO8P] 98 - Hình 4.6. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PI 34:1 [C43H79O13P] . 100 + Hình 4.7. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của MGDG 38:9 [C47H72O10Na] . 102 - Hình 4.8. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của DGDG 34:1 [C49H89O15] . 104 - Hình 4.9. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của SQDG 34:1 [C43H79O12S] 106 + Hình 4.10. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của DGTS 28:0 [C38H74NO7] . 109 + Hình 4.11. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của DGTA 34:1 [C44H84NO7] 111 - Hình 4.12. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PG 34:3 [C40H72O10P] . 114 - Hình 4.13. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PG 34:4 [C40H70O10P] . 115 - Hình 4.14. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PI 32:0 [C41H78O13P] . 116
15. xiii - Hình 4.15. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PI 36:4 [C45H78O13P] . 117 + Hình 4.16. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của MGDG 30:0 [C39H74O10Na] . 119 + Hình 4.17. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của DGDG 32:0 [C47H88O15Na] . 121 - Hình 4.18. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của SQDG 32:0 [C41H77O12S] 123 + Hình 4.19. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của DGTS 30:0 [C40H78NO7] . 124 + Hình 4.20. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của DGTS 34:3 [C44H80NO7] . 125
16. 1 MỞ ĐẦU Nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển trong đó có đối tượng rong biển là hướng nghiên cứu quan trọng trong thế kỉ 21. Nhiều hoạt chất từ rong biển có khả năng ứng dụng trong y dược điển hình như: Curacin-A (chiết từ một loài rong tại bờ biển Curacao - phía nam biển Caribe), thể hiện hoạt tính chống ung thư vú cao hơn cả taxol; Fucoidan, một loại sulphat polysaccharide, chiết từ rong Nâu có khả năng ngăn ngừa di căn của ung thư, điều trị và hỗ trợ điều trị một số bệnh nan y như ung thư, viêm loét dạ dày, rối loạn đường tiêu hóa. Đặc biệt Kahalalide F (KF) chiết tách từ loài rong Lục Bryoptic sp. được công nhận là một hợp chất chống ung thư mới tiềm năng với các loại ung thư vú, ung thư phổi, ung thư máu và một số loại ung thư dạng rắn đã được thử lâm sàng và nghiên cứu dược động học. Với tổng số khoảng 1000 loài được tìm thấy ở vùng biển Việt Nam, rong biển trở thành một đối tượng kinh tế quan trọng của nước ta. Với công nghệ khai thác hiện nay, rong biển có khả năng cung cấp nhiều sản phẩm quan trọng và có ý nghĩa lớn đối với ngành công nghiệp như alginate, carrageenan và fucoidan. Những năm gần đây hướng nghiên cứu về lipid rong biển cũng nhận được nhiều sự quan tâm vì tác dụng của chúng đối với các bệnh về xương khớp, tim mạch và não. Các axit béo không no nhiều nối đôi như axit arachidonic (AA), axit eicosapentaenoic (EPA), axit docosahexaenoic (DHA) trong lipid rong biển có tác dụng ức chế cạnh tranh làm hạn chế hình thành các chất tiền viêm (leucotrien, thromboxane ) và monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) từ rong Lục có tác dụng kháng u, sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) ức chế DNA-polymerase và HIV Lipid bao gồm nhiều nhóm hợp chất hóa học riêng biệt được đặc trưng bởi phần phân cực. Mỗi nhóm lại bao gồm nhiều hợp chất, chỉ khác nhau về thành phần và vị trí các gốc acyl (alkyl, alkenyl) trong phân tử được gọi là các “dạng phân tử”. Sự đa dạng của các axit béo trong lipid sinh vật biển khiến cho số lượng các dạng phân tử là rất lớn (50 - 200) và việc phân lập riêng từng chất là vô cùng khó khăn. Điều này gây trở ngại cho các nhà khoa học trong việc nghiên cứu hóa học, hoạt tính sinh học các cấu trúc lipid, đặc biệt là các phân tử lipid phức tạp cũng như sử dụng chúng trong các sản phẩm dược. Do vậy, hầu hết các nghiên cứu từ trước tới
17. 2 nay về lipid sinh vật biển mới chỉ phân tích thành phần, hàm lượng các lớp chất lipid, thành phần và hàm lượng các axit béo trong lipid tổng và trong một số lớp chất lipid riêng biệt. Một trong những định hướng nghiên cứu hiện đại là đi sâu vào từng lớp chất lipid, tiến hành phân tích và nhận dạng được các dạng phân tử có mặt trong lớp chất đó mà không cần phân lập từng hợp chất lipid riêng rẽ. Hiện nay, với sự góp sức của các thiết bị nghiên cứu hiện đại, khoa học thế giới đã đạt được những tiến bộ lớn trong việc phân tích các thành phần hóa học ở dạng phân tử của một số lớp lipid phân cực. Trên thế giới chỉ có một số ít loài rong biển được nghiên cứu và công bố về dạng phân tử của lipid trong những năm gần đây. Có thể nói việc nghiên cứu rong biển vẫn đang là chủ đề được nhiều nhà khoa học quan tâm, trong đó việc nghiên cứu sâu hơn về lipid và các dạng phân tử của lipid phân cực trên đối tượng này thu hút được sự chú ý cao vì các giá trị lớn trong thực phẩm, y dược và công nghiệp. Tại Việt Nam, lipid rong biển mới chỉ được nghiên cứu hóa sinh thuần túy bằng các kỹ thuật truyền thống. Với mục tiêu tiếp cận hướng nghiên cứu hiện đại, xây dựng dữ liệu điều tra cơ bản về rong biển Việt Nam, trợ giúp cho lĩnh vực phân loại rong biển và tìm hiểu mối tương quan giữa đa dạng sinh học và đa dạng hóa học. Tạo cơ sở khoa học để định hướng bảo tồn, nuôi trồng và phát triển, sử dụng hiệu quả nguồn lợi rong biển. Gắn kết việc công bố những kết quả nghiên cứu mới với việc khẳng định chủ quyền biển đảo và toàn vẹn lãnh thổ Việt Nam, đề tài luận án “Nghiên cứu thành phần và hoạt tính sinh học của lipid trong một số loài rong biển ở Việt Nam” có các nội dung sau: 1. Nghiên cứu sàng lọc lipid và axit béo trong 60 mẫu của 50 loài rong biển thuộc các ngành rong Đỏ, rong Nâu và rong Lục. 2. Xác định các dạng phân tử lipid phân cực của hai loài chọn lọc thu ở các vùng đảo xa bờ đặc thù của Việt Nam là Côn Đảo và Quần đảo Trường Sa. 3. Khảo sát hoạt tính sinh học in vitro của các phân đoạn lipid từ hai loài đã lựa chọn.
18. 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong biển 1.1.1. Giới thiệu chung Rong biển là nhóm thực vật bậc thấp sống trong thủy vực nước mặn và nước lợ tại các vùng cửa sông, ven biển và các đảo xa bờ. Đây là nhóm thực vật có khả năng quang hợp tạo ra các sản phẩm hữu cơ từ các chất vô cơ nên có tốc độ phát triển rất nhanh, tạo ra nguồn sinh khối lớn trong thời gian ngắn, thường phân bố ở vùng triều, vùng nước nông ven bờ cho đến độ sâu 60m (một vài loài có thể ở độ sâu đến hàng trăm mét). Kích thước của rong rất khác nhau, có loại có kích thước rất nhỏ (microalgae) từ vài µm (các diatom), có loại đạt kích thước hàng chục mét (macroalgae) như rong Bẹ thuộc ngành rong Nâu chiều dài tới 65m. Hiện nay, người ta đã biết được gần 160.000 loài rong biển. Tuy không có thân, lá, rễ và hệ thống mao mạch phân hóa rõ rệt như ở thực vật bậc cao, nhưng chúng có khả năng bám vào các giá thể nhờ các chân bám hoặc bàn bám và hấp thụ trực tiếp chất dinh dưỡng từ nước để tổng hợp nên chất hữu cơ trong quá trình quang hợp [1-5]. Rong biển, thông qua quá trình quang hợp, có thể hấp thụ CO2 để tổng hợp các hợp chất hữu cơ cung cấp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể, từ đó cung cấp năng lượng cho hệ sinh thái biển. Chúng có thể hấp thụ nhanh các chất ô nhiễm từ nước biển, góp phần cải tạo môi trường nước biển phục vụ nuôi trồng các loài hải sản khác. Nhóm rong Vôi cùng với san hô và trùng lỗ góp phần hình thành các rạn và bảo vệ nền đáy trước tác động của bão lũ, dòng chảy ven bờ Có thể nói, nếu không có rong biển thì vùng nước chỉ là thủy mạc, mất đi quá trình trao đổi dinh dưỡng và năng lượng trong các hệ sinh thái biển. Rong biển là đối tượng có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như các sắc tố của hệ quang tổng hợp, các polysaccharide, lipid dự trữ, carotenoid, steroid, các vitamin có tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực y, dược. Người ta còn sử dụng rong biển trong vấn đề khử độc, loại bỏ các nguyên tố kim loại nặng độc hại hay các nguyên tố phóng xạ như strontium khỏi cơ thể. Trong y học dân gian, tuy không có một lịch sử lâu dài như các sinh vật trên cạn nhưng các sinh vật biển trong đó có rong biển đã được sử dụng khá rộng rãi. Người Nhật sử dụng rong biển để trị giun sán (các loài rong này chứa một lượng lớn axit kainic), dùng rong biển chi Laminaria để chữa bệnh cao huyết áp hay phụ nữ Nhật sử dụng nhiều rong
19. 4 biển (Chlorella và Spirulina) trong bữa ăn để phòng ngừa ung thư nên tỷ lệ ung thư vú chỉ bằng 1/3 so với phụ nữ Mỹ. Y học Trung Quốc sử dụng rong biển trong điều trị viêm hoặc sử dụng phối hợp với thuốc tân dược, đặc biệt trong điều trị u tuyến giáp, ngoài các loại thuốc tân dược, đơn thuốc bao giờ cũng kèm rong Laminaria và Sargassum [4,6]. Trên thế giới có nhiều quan niệm phân loại rong biển, một số cách phân loại được công nhận nhiều như: Theo màu sắc, rong được phân loại như sau: rong Lục (Green algae), rong Đỏ (Red algae), rong Nâu (Brown algae), rong Nâu Vàng (Golden-Brown), rong Nâu Vàng nhạt (Yellow-Brown), Tảo silic (Diatom), Tảo Giáp (Dinoflagellate), Tảo Lam (Blue green algae) [4,6,7]. Trong đó rong Đỏ, rong Nâu và rong Lục là những loại rong biển quan trọng nhất. Theo phân loại khoa học (taxonomy), một số tác giả đã đưa ra hệ thống phân loại rong biển theo các ngành, trong đó Gollerbakh chia rong biển thành 10 ngành: Ngành Khuẩn Lam - Cyanophyta Ngành Tảo Giáp - Pyrrophyta Ngành Tảo Vàng ánh - Chrysophyta Ngành Tảo Khuê - Bacillariophyta Ngành Rong Nâu - Phaeophyta Ngành rong Đỏ - Rhodophyta Ngành Tảo Vàng – Xanthophyta Ngành Tảo Mắt – Euglenophyta Ngành Rong Lục - Chlorophyta Ngành Tảo Vòng - Charophyta Philip Size dựa trên thang tiến hóa, tác giả đã xếp các loài rong vào 9 ngành: Cyanophyta, Rhodophyta, Chlorophyta, Chromophyta, Haptophyta, Pyrrophyta - Dinophyta, Cryptophyta, Euglenophyta, Chrarachniophyta [4,6,7]. 1.1.2. Đa dạng loài và phân bố rong biển ở Việt Nam Cho đến nay, Việt Nam đã ghi nhận được 827 loài rong biển [8] và một số loài mới được bổ sung nên số lượng loài có thể còn nhiều hơn. Trong số các loài rong biển đã phát hiện được ở vùng biển Việt Nam, có khoảng 150 loài được xem là có giá trị kinh tế [4,9].
20. 5 Việt Nam có bờ biển dài (khoảng 3.260km), trải trên nhiều vĩ độ nên khu hệ rong biển Việt Nam cũng mang các đặc trưng khác nhau. Từ Móng Cái (Quảng Ninh) đến hết Quảng Trị là khu hệ á nhiệt đới (cận Nhiệt đới), từ Thừa Thiên- Huế đến hết Quảng Nam là khu hệ hỗn hợp và từ Bình Định trở vào là khu hệ nhiệt đới. Các loài rong biển phân bố rất rộng, dọc theo các tỉnh ven biển Việt Nam và các đảo gần bờ (Thanh Lân - Cô Tô, Vịnh Bái Tử Long, Vịnh Hạ Long, Cát Bà, Hòn Mê, Hòn Mát, Cồn Cỏ, Cù Lao Chàm, Lý Sơn, Vịnh Nha Trang, Hòn Cau, Phú Quốc) hoặc xa bờ (Bạch Long Vĩ, Côn Đảo, Hoàng Sa, Trường Sa, Nam Du). Số lượng loài tại các vùng hoàn toàn khác nhau phụ thuộc vào đặc điểm nền đáy, độ muối, độ trong, dòng chảy, Số lượng và kích thước loài tuân theo quy luật phân bố của sinh vật thủy sinh, càng về xích đạo số lượng loài càng lớn nhưng kích thước cá thể lại giảm. Chi Lobophora thuộc họ Dictyotaceae, ngành rong Nâu (Phaeophyta), về mặt phân loại học có khoảng 53 loài được liệt kê trong AlgaeBase [9] và mới chỉ có 45 loài đã được chấp nhận phân loại trên cơ sở tài liệu được chấp nhận tên loài hợp lệ [10]. Riêng ở Việt Nam, cho đến nay chi Lobophora mới chỉ phát hiện được duy nhất một loài là Lobophora variegata [2,3,8]. Trong quá trình thu mẫu, chúng tôi đã thu được loài rong biển mới Lobophora sp. Đây là loài rong mới được phát hiện lần đầu tiên ở vùng biển dưới triều, trên san hô chết ở độ sâu 3-5m tại Côn Đảo thuộc tỉnh Bà Rịa- Vũng Tàu [11]. Chi Halimeda thuộc họ rong vôi (Halimedaceae), ngành rong Lục (Chlorophytes), là một trong các chi rong biển phổ biến và quan trọng, nhất là ở các đảo xa bờ thuộc vùng biển nhiệt đới. Cùng với san hô, chúng góp phần hình thành các rạn và bảo vệ nền đáy trước tác động của bão lũ, dòng chảy ven bờ [12]. Quần đảo Trường Sa là nơi đa dạng loài nhất của chi này, ở đó loài Halimeda incrassata Lamx. phân bố khá tập trung [13,14]. Một số nhóm loài đang được nuôi trồng rộng rãi hay khai thác tự nhiên với sản lượng lớn chủ yếu tập trung vào các chi: Gracilaria (rong Câu), Sargassum (rong Mơ) và Ulva (rong Cải biển). Trong các chi đó, một số loài có trữ lượng lớn, được coi là nguồn lợi như chi Gracilaria (loài Gracilaria tenuistipitata - rong Câu chỉ vàng, Gracilariopsis bailinea - rong Câu cước), chi Sargassum (loài S. mucclurei, S. polycystum, S. congkinhii, S. microcystum, S. crassifolium ), chi
21. 6 Ulva (Ulva lactuca, Ulva conglobata). Trừ một số loài có thể nuôi trồng, các loài có sản lượng tự nhiên (chủ yếu là các loài rong Mơ) hoặc bị bỏ hoang hoặc khai thác một cách tự phát dẫn tới nguy cơ cạn kiệt nguồn tài nguyên này. Mặc dù rong biển là nguồn tài nguyên rất quan trọng nhưng các công trình nghiên cứu và sử dụng nguồn lợi này còn khá ít, rải rác nên rất khó khăn cho việc khai thác, bảo vệ và phát triển giá trị nguồn lợi. 1.1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của rong biển Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Hàm lượng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài, điều kiện sống, sinh trưởng và phát triển. Các glucid của rong biển được chia thành 2 nhóm: monosaccharide và polysaccharide. Nhóm monosaccharide gồm các đường đơn như: manitol, fucose, galactose, manose, xylose, trong đó quan trọng nhất là manitol. Manitol là một alcohol đường, thường có nhiều trong rong Nâu, được phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913. Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng manitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc. Hàm lượng manitol trong rong biển thường cao vào các tháng mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng. Manitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [2,3,9]. Nhóm polysaccharide gồm có: laminaran, alginate, agar, carrageenan và fucoidan Laminaran (1) đóng vai trò như chất dự trữ trong rong và là chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch ở động vật có vú, laminaran sulfat hóa đã được chứng minh là có đặc tính giống heparin. Laminaran dễ hòa tan, nhưng mức độ hòa tan phụ thuộc vào mức độ phân nhánh, độ phân nhánh càng cao thì mức độ hòa tan càng lớn, do đó nếu độ phân nhánh nhỏ thì chỉ có thể hòa tan trong nước ấm (60- 800C). Laminaran có hoạt tính chống đông tụ máu và chống ung thư. Hợp chất laminaran có trong rong biển có thể hỗ trợ không để tế bào miễn dịch “tử vong”, từ đó có tác dụng bảo vệ hệ thống miễn dịch không bị tổn thương dưới tác động của tia bức xạ. Khả năng chống tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên nhiên này đem
22. 7 lại niềm hi vọng cho những người đang dùng tia phóng xạ chữa trị các khối u gây ung thư trong cơ thể. Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng sức đề kháng, hạn chế nhiễm trùng và thúc đẩy quá trình chữa lành vết thương [15,16]. Agar (2) được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, được sử dụng làm chất ổn định trong bánh kẹo, kem, nước ngọt hay chất làm đông đặc và tạo gel trong sản xuất thịt đông lạnh. Trong công nghệ sinh học, agar được dùng làm môi trường nuôi cấy, trong y học dùng làm vải băng bó vết thương truyền thống, lấy dấu răng, pha thuốc, pha huyết thanh, [15]. Alginate (3) tạo kết tủa bền với strontium do đó ngăn ngừa được sự hấp thu strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được thải theo phân ra ngoài. Việc dùng alginate làm chất tẩy xạ không ảnh hưởng đến quá trình trao đổi ion Ca2+ và khả năng phát triển bình thường của cơ thể. Ngoài ra một số nghiên cứu cũng cho thấy alginate còn có khả năng chống oxy hóa, tác dụng chống đông tụ máu, phòng xơ vữa động mạch ở trẻ em hay sử dụng trong thành phần của thuốc chống chảy máu dạ dày [15]. (1) (2) (3) (4) (5) Hình 1.1. Cấu tạo hóa học của một số hợp chất polysaccharide
23. 8 Carrageenan (4) là một ionic polysaccharide mạch thẳng được sulfate hóa, chúng mang đầy đủ tính chất đặc trưng của polysaccharide. Carrageenan có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch, chúng tồn tại trong một số loài rong Đỏ. Hiện nay, carrageenan thường được chiết từ một số loài rong thuộc các chi như Gigartina, Chondrus, Iridea, Eucheuma. Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc cũng như khả năng tạo gel khác nhau. Fucoidan (5) là một anion polysaccharide sulfat hóa nằm trong thành tế bào của rong Nâu. Hợp chất này được Kylin mô tả đầu tiên vào năm 1913 từ loài rong Nâu Laminaria digitata. Thành phần cấu tạo phức tạp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7% đến 32,9%, ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose và axit uronic. Hợp chất fucoidan được quan tâm nghiên cứu nhờ các hoạt tính sinh học đa dạng và đặc thù của nó như khả năng tăng cường miễn dịch, chống đông tụ máu, chống viêm nhiễm, kháng virus, điều trị rối loạn đường huyết và hỗ trợ trong điều trị ung thư [17] . Castro và cộng sự đã nghiên cứu polysaccharide sunfat có chứa fucose từ rong Nâu Lobophora variegata. Nghiên cứu này đã phân tích các polysacarit sunfat và cho thấy các fucans từ rong Lobophora variegata có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm và gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 [18]. Stephan Kremb và cộng sự đã khảo sát hoạt tính ức chế HIV-1 tiềm năng của loài Lobophora variegata được thu thập từ các khu vực địa lý khác nhau bằng mô hình nhân bản HIV-1 trong tế bào. Dịch chiết nước của Lobophora variegata có tác dụng ức chế mạnh đối với một số chủng HIV-1, bao gồm các chủng HIV-1 kháng thuốc, kháng kháng nguyên và khả năng bảo vệ các tế bào nguyên phát khỏi nhiễm HIV-1. Khả năng chống virus có liên quan đến các yếu tố sinh thái, có sự khác biệt rõ ràng tùy thuộc vào điều kiện ánh sáng hoặc tăng trưởng biểu mô. Các thử nghiệm liên quan đến các yếu tố mở đầu của chu kỳ nhân bản HIV-1 cho thấy dịch chiết từ loài Lobophora variegata đã ức chế sự xâm nhập của HIV-1 vào tế bào bằng cách cản trở sự di chuyển của virus [19]. Vieira và cộng sự (2017, 2019) đã tổng hợp 49 công trình nghiên cứu của nhiều tác giả trong giai đoạn 1987-2019 về chi Lobophora nhằm cung cấp các thông