Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ Cua Lột (Scylla)

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ Cua Lột (Scylla)

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  NGUYỄN THỊ PHƢƠNG LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN SẢN PHẨM CÓ TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG SỨC KHỎE TỪ CUA LỘT (SCYLLA) LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội- 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  NGUYỄN THỊ PHƢƠNG LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN SẢN PHẨM CÓ TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG SỨC KHỎE TỪ CUA LỘT (SCYLLA) LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 9.52.03.01 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến 2. TS. Lê Tất Thành Hà Nội- 2021
3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam Ďoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến và TS. Lê Tất Thành. Các số liệu và kết quả thu Ďược trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa Ďược công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Lan
4. ii LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng, lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến và TS. Lê Tất Thành là những người thầy Ďã hướng dẫn tận tình và tạo mọi Ďiều kiện giúp Ďỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin Ďược cảm ơn sự giúp Ďỡ và tạo Ďiều kiện thuận lợi của Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án. Tôi cũng xin Ďược cảm ơn sự quan tâm, giúp Ďỡ của GS.TS. Phạm Quốc Long, Ban Lãnh Ďạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, những người Ďã cùng tôi chia sẻ công việc cũng như Ďộng viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển sản phẩm thiên nhiên - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Ďã giúp Ďỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận án. Đặc biệt, tôi xin Ďược bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể những người thân trong gia Ďình tôi, bạn bè Ďã Ďộng viên Ďể tôi có thể hoàn thiện Ďược luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Lan
5. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG xi DANH MỤC HÌNH xiii MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cua Scylla spp. 2 1.1.1. Giới thiệu chung về cua 2 1.1.2. Giới thiệu về chi cua bùn Scylla 2 1.1.3. Giới thiệu chung về cua lột và nghề nuôi cua lột 6 1.1.4. Tình hình sử dụng, chế biến cua lột 9 1.2. Các nghiên cứu hóa học về cua 9 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cua biển trên thế giới 9 1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài cua bùn Scylla 14 1.2.3. Nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học của các loài cua 16 1.2.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa 17 1.2.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật 17 1.2.3.3. Các hoạt tính khác 18 1.2.3.4. Hoạt tính của lipid và phospholipid 19 1.3. Công nghệ thuỷ phân protein trong chế biến thực phẩm 20 1.3.1. Giới thiệu chung 20 1.3.2 Tính chất hóa lý của protein thủy phân 21 1.3.3. Hoạt tính sinh học của protein thủy phân 21 1.3.4. Ứng dụng của protein thủy phân 22 1.3.5. Các phương pháp thủy phân protein 22 1.4. Giới thiệu về quy hoạch thực nghiệm và tối ƣu hóa quy trình công nghệ hóa học 26
6. iv 1.4.1. Giới thiệu về quy hoạch thực nghiệm (Phương pháp bề mặt đáp ứng – RSM) 26 1.4.2. Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert 12.0 28 1.5. Định hƣớng nghiên cứu 29 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 32 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.2.1. Các phương pháp xác định thành phần hóa học 33 2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 34 2.2.3. Phương pháp thủy phân bằng công nghệ enzym 35 2.2.4. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình công nghệ 36 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM 37 3.1. Sơ chế và xử lý mẫu cua lột 37 3.2. Sơ đồ nghiên cứu mẫu cua lột 38 3.3. Phân tích các thành phần hóa học cơ bản 38 3.3.1. Xác định hàm lượng ẩm 38 3.3.2. Xác định hàm lượng tro 39 3.3.3. Xác định hàm lượng protein 39 3.3.4. Xác định hàm lượng lipid t ng 40 3.3.5. Xác định các vitamin 40 3.3.5.1. Vitamin A, D, E 40 3.3.5.2. Xác định vitamin K 41 3.3.5.3. Xác định vitamin B2, B3 42 3.3.6. Xác định khoáng chất 42 3.3.6.1. Xác định Ca, Mg, Na, K, P, Fe, Zn 42 3.3.6.2. Phương pháp xác định Cu, Mn 43 3.3.7. Xác định cholesterol, ecdysone 44 3.4. Phân tích thành phần và hàm lƣợng axit amin 45 3.5. Xác định thành phần và hàm lƣợng các axit béo 46 3.6. Xác định thành phần và hàm lƣợng các lớp chất lipid trong lipid tổng 47 3.7. Phân tích các dạng phân tử của lipid phân cực 47
7. v 3.7.1. Xác định các nhóm chất trong từng phân lớp lipid phân cực 48 3.7.2. Xác định các dạng phân tử của phân lớp phospholipid 49 3.8. Thử nghiệm hoạt tính sinh học 57 3.8.1. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 57 3.8.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp đo malondialdehyde (MDA) 58 3.8.3. Thử nghiệm hoạt tính kháng viêm 58 3.8.4. Thử nghiệm hoạt tính chống loãng xương của sản phẩm thủy phân cua lột và sản phẩm thực phẩm chức năng từ bột cua lột thuỷ phân 60 3.9. Nghiên cứu và tối ƣu hóa quá trình thủy phân cua lột bằng enzym 62 3.9.1. Thiết bị và nguyên liệu 63 3.9.2. Quy trình chung cho phản ứng thủy phân 63 3.9.3. Xác định độ thủy phân (phương pháp OPA) và hàm lượng peptid 64 3.9.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 66 3.9.5. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân 67 3.10. Nghiên cứu và tối ƣu hóa quá trình sấy phun 67 3.10.1. Thiết bị và nguyên liệu 67 3.10.2. Quy trình chung 68 3.10.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy phun 68 3.10.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sấy phun 68 3.11. Sản xuất bột cua lột thủy phân ở qui mô pilot 69 3.12. Sơ đồ định hƣớng nghiên cứu quy trình công nghệ tạo sản phẩm có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm 69 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 71 4.1 Thành phần hóa học của cua lột Scylla paramamosain 71 4.1.1. Các thành phần hóa học cơ bản 71 4.1.1.1. Hàm lượng ẩm và tro của cua lột 71 4.1.1.2. Hàm lượng protein 72 4.1.1.3. Hàm lượng lipid 72 4.1.1.4. Hàm lượng vitamin 73 4.1.1.5. Hàm lượng khoáng chất 74 4.1.2. Thành phần và hàm lượng các axit amin 76
8. vi 4.1.3. Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid của cua lột 77 4.1.4. Thành phần và hàm lượng các axit béo 80 4.1.5. Xác định các dạng phân tử của lớp chất phospholipid 83 4.1.6. Hàm lượng cholesterol và ecdysone trong quá trình lột xác của cua lột 96 4.2. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các lớp chất lipid của cua lột 98 4.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm 99 4.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 101 4.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 101 4.3. Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình thủy phân cua lột bằng enzym 103 4.3.1. Nghiên cứu lựa chọn enzym cho quá trình thủy phân 103 4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình 105 4.3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH 105 4.3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 105 4.3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào nguyên liệu 106 4.3.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzym/cơ chất (E/S) 107 4.3.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân 108 4.3.3. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng phương pháp bề mặt đáp ứng 108 4.3.3.1. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm 108 4.3.3.2. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình 111 4.3.3.3. Tối ưu hóa quy trình thủy phân 113 4.3.3.4. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa 114 4.4. Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình sấy phun sản phẩm thủy phân cua lột115 4.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm của quá trình sấy phun 115 4.4.1.1. Ảnh hưởng của tốc độ đầu phun đến chất lượng sản phẩm 115 4.4.1.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm 116 4.4.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ khí sấy đầu vào đến chất lượng sản phẩm 117
9. vii 4.4.1.4. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến chất lượng sản phẩm 118 4.4.2. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sấy phun bằng phương pháp bề mặt đáp ứng 119 4.4.2.2. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình 119 4.4.2.3. Tối ưu hóa quy trình sấy phun 122 4.4.2.4. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa 123 4.5. Sản xuất bột cua lột thủy phân ở quy mô pilot 123 4.5.1. Quy trình sản xuất 123 4.5.2. Thành phần hóa học của sản phẩm thủy phân cua lột 126 4.5.2.1. Thành phần và hàm lượng dinh dưỡng chính 126 4.5.2.2. Thành phần và hàm lượng khoáng chất 127 4.5.3. Hoạt tính chống loãng xương của sản phẩm thủy phân cua lột và sản phẩm thực phẩm chức năng Boness từ bột cua lột thuỷ phân 127 4.6. Bào chế sản phẩm có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe từ bột cua lột thủy phân 130 4.6.1. Sản phẩm “Forté Kid” chống còi xương ở trẻ em 130 4.6.1.1. Các nguyên liệu chính sử dụng để bào chế sản phẩm Forté Kid 130 4.6.1.2. Quy trình bào chế bột dinh dưỡng Forté Kid 130 4.6.1.3. Đánh giá cảm quan kết quả của bột dinh dưỡng 132 4.6.1.4. Công thức sản phẩm Forté Kid 132 4.6.2. Sản phẩm “Boness” chống loãng xương 133 4.6.2.1. Các nguyên liệu chính sử dụng để bào chế sản phẩm Boness 133 4.6.2.2. Xác định tá dược độn 134 4.6.2.3. Quy trình bào chế sản phẩm chống loãng xương Boness 134 4.6.2.4. Công thức sản phẩm chống loãng xương Boness 136 KẾT LUẬN 137 KIẾN NGHỊ 138 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 139 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 140 TÀI LIỆU THAM KHẢO 141
10. viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải AA Axit arachidonic ABTS Axit 2,2’- Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic ADN Axit deoxyribonucleic ALF Antilipopolysaccharide factor ALP Enzym alkaline phosphatase AMP Peptide kháng vi sinh vật AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thống ARN Axit ribonucleic AU Anson unit CAT Enzym catalase CL Cardiolipin DH Độ thủy phân (Degree of hydrolysis) DHA Axit docosahexaenoic DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EAA Axit amin thiết yếu (Essential amino acids) EI Ion hóa electron (electron ionization) EPA Axit eicosapentaenoic Phương pháp ion hóa phun mù Ďiện tử (ElectroSpray ESI Ionization) FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp quốc FBS Huyết thanh phôi bò (fetal bovine serum) FFA Axit béo tự do (Free fatty acids) FMOC-Cl 9-fluorenylmethyl cloroformat GC Sắc ký khí (Gas chromatography) Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography–mass GC-MS spectrometry) GPx Enzym glutathione peroxidase GR Enzym glutathione reductase
11. ix HepG-2 Dòng tế bào ung thư gan HepG-2 (Human liver cancer cell line) HL-60 Dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp HL-60 (Human promyelocytic leukemia cell line) Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid HPLC chromatography) Phố khối phân giải cao (High-resolution mass HRMS spectrometry) HT-29 Dòng tế bào ung thư Ďại tràng HT-29 (Human colorectal adenocarcinoma cell line) HUFA Axit béo không no, rất nhiều nối Ďôi (Highly unsaturated fatty acids) Nồng Ďộ ức chế 50% (Half maximal inhibitory IC50 Concentration) Quang phổ phát xạ plasma cảm ứng (Inductively ICP-OES coupled plasma - optical emission spectrometry) LAPU Leucine Amino Peptidase Units LC Sắc ký lỏng ( Liquid chromatography) LNCaP Dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến LNCaP (Human prostatic carcinoma cell line) LPC Lysophosphatidylcholine LPE Lysophosphatidylethanolamine LPS Lipopolysaccharides LU-1 Dòng tế bào ung thư phổi LU-1 (Human lung cancer cell line) MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (Human breast cancer cell line) MS Khối phổ (Mass spectrometry) (3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H- MTT tetrazolium bromide) MUFA Axit béo không no, một nối Ďôi (Monounsaturated fatty acids) NCI Viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ NEAA Axit amin không thiết yếu (Non-essential amino acids ) NL Lipid không phân cực (Non Polar Lipid) OD Mật Ďộ quang
12. x OPA ortho-phthalic aldehyde PC Phosphatidylcholine PDA Detector dãy diod quang PE Phosphatidylethanolamine PG Phosphatidylglycerol PI Phosphatidylinositol PL Phospholipid Pol Lipid phân cực (Polar lipid) PS Phosphatidylserine Axit béo không no Ďa nối Ďôi (Polyunsaturated fatty PUFA acids) ROS Loài oxi phản ứng (Reactive Oxygene Species) S. olivacea Scylla olivacea S. paramamosain Scylla paramamosain S. serrata Scylla serrata S. tranquebarica Scylla tranquebarica SAFA/SFA Axit béo no (Saturated fatty acids) SK-Mel 2 Dòng tế bào u ác tính SK-Mel 2 (Human Melanoma Cell Line) SOD Enzym superoxide dismutase SPH Sphingomyelin SRB Sulforhodamine B SW-480 Dòng tế bào ung thư trực tràng (Human colon adenocarcinoma) TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TCVN Tiêu chuẩn quốc gia UI Đơn vị quốc tế (unit international) Quang phổ hấp thụ phân tử ngoại khả kiến (Ultraviolet- UV-VIS visible spectroscopy) VAST Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam WHO Tổ chức Y tế thế giới
13. xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc Ďiểm hình thái của 4 loài cua bùn Scylla [4] 4 Bảng 1.2. Khu vực phân bố của các loài cua bùn Scylla [8] 6 Bảng 1.3. Thành phần hóa học của một số loài cua biển 10 Bảng 1.4. Thành phần hóa học của một số loài cua bùn Scylla 14 Bảng 1.5. Các peptid kháng vi sinh vật (AMP) Ďược xác Ďịnh trong các loài cua thuộc chi Scylla [40] 18 Bảng 3.1. Khoảng thời gian lưu của các nhóm chất 48 Bảng 3.2. Đường chuẩn xác Ďịnh nhóm amino bậc 1 với L-glutathion 64 Bảng 4.1. Hàm lượng ẩm và tro của cua lột 72 Bảng 4.2. Hàm lượng các vitamin trong cua lột 73 Bảng 4.3. Hàm lượng khoáng chất trong các mẫu cua lột (trên khối lượng khô) 75 Bảng 4.4. Hàm lượng các axit amin trong cua lột 76 Bảng 4.5. Hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng của cua lột (%) 79 Bảng 4.6. Thành phần và hàm lượng axit béo trong lipid của các mẫu cua lột (%) . 80 Bảng 4.7. Các dạng phân tử phosphatidylethanolamine Ďược xác Ďịnh 84 Bảng 4.8. Các dạng phân tử phosphatidylcholine Ďược xác Ďịnh 87 Bảng 4.9. Các dạng phân tử phosphatidylserine Ďược xác Ďịnh 89 Bảng 4.10. Các dạng phân tử phosphatidylinositol Ďược xác Ďịnh 91 Bảng 4.11. Các dạng phân tử lysophosphatidylethanolamine Ďược xác Ďịnh 93 Bảng 4.12. Các dạng phân tử lysophosphatidylcholine Ďược xác Ďịnh 94 Bảng 4.13. Hàm lượng cholesterol và ecdysone trong quá trình lột xác cua bùn 96 Bảng 4.14. Khả năng ức chế sự sản sinh NO của các mẫu nghiên cứu 100 Bảng 4.15. Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid 101 Bảng 4.16. Khả năng ức chế 5 dòng tế bào ung thư của lipid từ cua lột 102 Bảng 4.17. Hàm lượng khoáng của mai và vỏ mềm cua trước và sau khi thủy phân 104 Bảng 4.18. Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng 109 Bảng 4.19. Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm 110 Bảng 4.20. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y 111 Bảng 4.21. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ 114
14. xii Bảng 4.22. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại Ďiều kiện tối ưu 114 Bảng 4.23. Ảnh hưởng của tốc Ďộ Ďĩa phun Ďến hàm mục tiêu Y1 và Y2 115 Bảng 4.24. Các mức thí nghiệm của các biến công nghệ 116 Bảng 4.25. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình sấy phun 117 Bảng 4.26. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ khí sấy cấp vào Ďến hàm mục tiêu Y1 và Y2117 Bảng 4.27. Ảnh hưởng của tốc Ďộ bơm dịch Ďến hàm mục tiêu Y1 và Y2 118 Bảng 4.28. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2 119 Bảng 4.29. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ 122 Bảng 4.30. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại Ďiều kiện tối ưu 123 Bảng 4.31. Thành phần và hàm lượng axit amin trong bột cua lột thủy phân 126 Bảng 4.32. Thành phần và hàm lượng khoáng chất trong bột cua lột thủy phân 127 Bảng 4.33. Ảnh hưởng của mẫu Ďến sự phát triển của tế bào 128 Bảng 4.34. Tác Ďộng của mẫu nghiên cứu Ďến hoạt Ďộng của ALP 128 Bảng 4.35. Tác Ďộng của mẫu nghiên cứu Ďến sự tổng hợp collagen 129 Bảng 4.36. Tác Ďộng của mẫu nghiên cứu Ďến sự tạo khoáng 129 Bảng 4.37. Kết quả Ďánh giá cảm quan tỉ lệ bột dinh dưỡng 132 Bảng 4.38. Chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của sản phẩm Forté Kid 133 Bảng 4.39. Thành phần hoạt chất chính và tá dược Ďộn 134 Bảng 4.40. Chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của sản phẩm Boness 136
15. xiii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cua Scylla serata 4 Hình 1.2. Cua Scylla tranquebarica 4 Hình 1.3. Cua Scylla paramamosain 5 Hình 1.4. Cua Scylla olivacea 5 Hình 2.1. Cua lột Scylla paramamosain 32 Hình 3.1. Các bước sơ chế cua lột 37 Hình 3.2. Sơ Ďồ nghiên cứu chung 38 Hình 3.3. Khoảng thời gian lưu của các nhóm chất khi sử dụng cột Diol 48 Hình 3.4. Đường chuẩn L-glutathion 65 Hình 3.5. Sơ Ďồ Ďịnh hướng nghiên cứu tạo sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột 70 Hình 4.1. Bản mỏng và sắc kí Ďồ các lớp chất lipid của cua lột 78 Hình 4.2. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PE 38:5 [C43H76NO7P] 84 Hình 4.3. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PE 38:6 [C43H74NO8P]. 85 Hình 4.4. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PC 34:1 [C42H82NO8P]. 88 Hình 4.5. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PS 38:5 [C44H76NO10P] 90 Hình 4.6. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PI 38:5 [C47H81O13P] 92 Hình 4.7. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của LPE/20:5 [C25H42NO7P]. 93 Hình 4.8. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của LPC 20:5 [C28H48NO7P] 95 Hình 4.9. Biểu Ďồ thể hiện mối tương quan giữa cholesterol và ecdysone 97 Hình 4.10. Kết quả khảo sát chu kỳ lột xác của cua 97 Hình 4.11. Ảnh hưởng của các enzym protease Ďến quá trình thủy phân cua lột 104 Hình 4.12. Ảnh hưởng của pH Ďến Ďộ thủy phân 105 Hình 4.13. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ thủy phân Ďến Ďộ thủy phân 106 Hình 4.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/nguyên liệu Ďến Ďộ thủy phân 106 Hình 4.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bromelain/nguyên liệu Ďến Ďộ thủy phân 107 Hình 4.16. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym chitinase/nguyên liệu Ďến Ďộ thủy phân 107 Hình 4.17. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Ďến Ďộ thủy phân 108 Hình 4.18. Biểu Ďồ thực nghiệm và dự Ďoán phân bố ngẫu nhiên của hàm mục tiêu Y 112
16. xiv Hình 4.19. Bề mặt Ďáp ứng của hàm mục tiêu Y 113 Hình 4.20. Kết quả tối ưu các biến công nghệ của quá trình thủy phân cua lột 114 Hình 4.21. Biểu Ďồ thực nghiệm và dự Ďoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 120 Hình 4.22. Bề mặt Ďáp ứng của protein tổng (a) và Ďộ ẩm (b) của sản phẩm sau sấy phun 121 Hình 4.23. Kết quả tối ưu các biến công nghệ của quá trình sấy phun 122 Hình 4.24. Quy trình sản xuất bột cua lột thủy phân bằng enzym 125 Hình 4.25. Quy trình bào chế bột dinh dưỡng Forté Kid 131 Hình 4.26. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Forté Kid 133 Hình 4.27. Quy trình bào chế viên chống loãng xương Boness 135 Hình 4.28. Sản phẩm chống loãng xương Boness từ cua lột 136
17. 1 MỞ ĐẦU Ở nước ta, cua bùn (Scylla spp.) là một Ďối tượng nuôi thủy sản nước mặn-lợ truyền thống, có giá trị kinh tế-xã hội quan trọng trong cộng Ďồng ngư dân ven biển và là nguồn thực phẩm ưa thích của số Ďông người Việt. Nghề nuôi cua bùn thương phẩm phát triển kéo theo sự phát triển của nghề nuôi cua lột Ďã làm tăng lên giá trị kinh tế của Ďối tượng này và làm Ďa dạng hơn nghề nuôi thủy sản. Nuôi cua lột cũng là một nghề truyền thống mà sản phẩm là những con cua vỏ mềm (Ďược gọi là cua lột), sau khi Ďã lột bỏ lớp vỏ cứng thay bằng lớp màng chitin mềm mại bao bọc cơ thể. Cho Ďến nay, sản phẩm cua lột chỉ Ďược sử dụng như một thực phẩm “ăn liền”, nghĩa là chỉ dừng ở việc sơ chế, Ďóng gói, bảo quản cấp Ďông rồi tiêu thụ nội Ďịa hoặc xuất khẩu Ďể làm nguyên liệu cho các nhà hàng chế biến ra hàng loạt các món ăn. Các nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cua lột cũng như công nghệ chế biến làm tăng giá trị, bào chế các sản phẩm có chất lượng cao còn rất hạn chế. Trong những năm gần Ďây, người tiêu dùng Việt Nam ngày càng quan tâm nhiều hơn Ďến các thực phẩm chức năng an toàn, có lợi cho sức khỏe. Những minh chứng xác thực về vai trò quan trọng của thực phẩm chức năng trong việc giảm thiểu bệnh và cải thiện sức khỏe Ďã và Ďang là Ďộng lực cộng hưởng thúc Ďẩy công nghệ chế biến trong lĩnh vực này phát triển mạnh mẽ. Trong Ďó, công nghệ enzym Ďược xếp hạng là một trong những công nghệ “xanh-sạch”, giữ vị trí tiên quyết tạo ra các hợp chất có thành phần giàu dinh dưỡng, hoạt tính sinh học cao, bao gồm các protein và peptid, các axit béo không no bão hòa (PUFAs), các probiotic và prebiotic, các chất xơ, các chất khoáng, Ďược sử dụng có Ďịnh hướng trong sản xuất các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chất lượng cao. Những năm qua, nhiều sản phẩm của công nghệ enzym Ďã Ďược sản xuất ở quy mô công nghiệp và Ďược thương mại hóa nhờ vào những ưu Ďiểm nổi trội của xúc tác enzym như tốc Ďộ phản ứng nhanh, có tính chuyên hóa cao, Ďiều kiện phản ứng Ďơn giản, không cần loại bỏ hóa chất dư thừa sau phản ứng ra khỏi sản phẩm cuối cùng và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất. Động vật thủy sản nói chung, các loài cua biển nói riêng là những thực phẩm có mùi vị, giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao, cần Ďược nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Với hàm lượng protein cao, chúng có thể Ďược sử dụng như một nguồn nguyên liệu lý tưởng Ďể thu nhận các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ďa dạng bằng công nghệ enzym nhằm phục vụ phát triển sản xuất các loại thực phẩm chức năng có giá trị gia tăng.
18. 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cua Scylla spp. 1.1.1. Giới thiệu chung về cua Động vật dạng cua (Cua) hay còn gọi là Phân thứ bộ Cua (danh pháp khoa học: Brachyura) là nhóm các loài Ďộng vật giáp xác, thân rộng hơn bề dài, mười chân có khớp, hai chân trước tiến hóa trở thành hai càng, vỏ xương bọc ngoài thịt, phần bụng nằm bẹp dưới hoàn toàn Ďược che bởi phần ngực, Ďầu cua và thân Ďược nối liền nhau vào một khối có lớp mai bọc bên ngoài. Hiện nay, theo thống kê của Walters và Johnson trên thế giới Ďã phát hiện khoảng gần 6.800 loài [1]. Tên gọi phổ biến của chúng bằng tiếng Việt khá Ďa dạng như cua, cáy, còng, Ďam, rạm, dã tràng, ghẹ, cà ra, Các tên gọi này chỉ Ďơn thuần dựa theo hình thái hoặc môi trường sống của chúng. Cua có nhiều tại tất cả các vùng biển, Ďại dương. Nhiều loài cua lại sống trong sông, suối, Ďồng ruộng, chẳng hạn như các loài trong họ Cua núi (Potamidae), hay họ Cua Ďồng (Parathelphusidae) và một số loài sống trên cạn (họ Gecarcinidae). Cua bùn (mud crabs), hay cua vùng ngập mặn (mangrove crabs), là tên thường gọi của một số loài cua sống trong bùn vùng ngập mặn, bao gồm các loài thuộc chi Scylla và một số loài cua thuộc họ Panopeidae và Xanthidae. 1.1.2. Giới thiệu về chi cua bùn Scylla Chi cua bùn Scylla là một chi (giống) cua biển thuộc họ Cua bơi (Portunidae), Liên họ Portunidae, Phân thứ bộ Brachyura, Phân bộ Pleocyemata, Bộ Decapoda, Lớp Malacostraca, Phân ngành Crustacea, Ngành Arthropoda, và Giới Animalia [2]. Trước Ďây, nhiều tác giả cho rằng giống cua Scylla chỉ có một loài S. serrata (Forskal, 1775) nhưng từ năm 1949, Estampador Ďã dựa trên tập tính Ďào bới bùn Ďất, màu sắc, các Ďặc trưng hình thái và cấu trúc nhiễm sắc thể Ďể công nhận 3 loài và 1 thứ trong chi Scylla có ở Philippines bao gồm: S. oceanica, S. tranquebarica, S. serrata và S. serrata var. paramamosain [3]. Năm 1952, Serene dựa vào mẫu thu Ďược ở miền Nam Việt Nam Ďã tách giống cua Scylla thành 4 loài: S. oceanica, S. tranquebarica, S. serrata và S. crassimana. Năm 1972, Starobogatov Y.I. cho rằng loài cua bùn ở Vịnh Bắc bộ là loài S. oceanica. Gần Ďây hơn, các nghiên cứu xác Ďịnh hình thái và allozym (dị enzym) Ďã chỉ ra sự hình
19. 3 thành loài trong phạm vi chi này. Điều này Ďã Ďược xác nhận trong sửa Ďổi phân loại chi Scylla thành 4 loài: S. serrata, S. tranquebarica, S. olivacea và S. paramamosain dựa trên Ďiện di allozym, xác lập trình tự ADN ti thể và phân tích hình thái. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng kết luận rằng 4 loài có thể chia tách dựa trên cơ sở các Ďặc trưng hình thái, hình dạng của các răng cửa, sự phân bố gai trên khối xương cổ chân (carpus) và cẳng chân (propodus) của chân kẹp (càng) và màu sắc [4]. Đặc điểm hình thái Theo nhóm tác giả Nguyễn Cơ Thạch [5], cua bùn Scylla spp. có các Ďặc Ďiểm sau: - Màu sắc: mặt lưng cua có màu xanh của lá sú vẹt già hay gần giống với màu xanh bùn (nên còn gọi là cua bùn), mặt bụng có màu vàng trắng xen lẫn chấm xanh Ďen, Ďôi chân bò thứ nhất (Ďôi càng) có kích thước bằng nhau, mặt lưng của càng có màu xanh bùn. - Kích thước và trọng lượng: cua tham gia sinh sản thường có trọng lượng từ 250-600 g tương ứng với chiều rộng giáp Ďầu ngực từ 10-12,5 cm. - Hình thái và cấu tạo: cơ thể cua dẹp theo hướng lưng bụng, toàn bộ cơ thể Ďược bao bọc trong lớp vỏ chitin dày. Cơ thể cua gồm 2 phần. Phần Ďầu và ngực cua dính liền nhau, ranh giới giữa các Ďốt không rõ ràng, Ďầu gồm 5 Ďốt, ngực có 8 Ďốt. Mé trước của giáp Ďầu ngực chia thành 3 Ďoạn phân cách bởi hai hố mắt, hai Ďoạn mé bên có chiều dài bằng nhau, mỗi bên mé có 9 gai nhọn có kích thước lớn dần theo thứ tự từ hốc mắt, Ďoạn giữa hai hốc mắt có 6 gai nhọn Ďều nhau. Phần bụng dạng phiến mỏng có 7 Ďốt, gập vào phần giáp Ďầu ngực (yếm cua), chân bụng bị thoái hóa không làm chức năng bơi lội. Ở con Ďực Ďôi chân bụng Ďầu tiên thoái hóa biến thành Ďôi gai giao cấu hình mũi kiếm; riêng Ďối với con cái, chân bụng phân thành hai nhánh có nhiều lông tơ Ďể kết dính trứng sau khi Ďẻ. Keenan mô tả hình thái của 4 loài cua bùn Scylla như sau (Bảng 1.1 và các Hình 1.1 - 1.4) [4]:
20. 4 Bảng 1.1. Đặc Ďiểm hình thái của 4 loài cua bùn Scylla [4] Tên loài Đặc điểm hình thái Gai thuỳ trán cao, nhọn, các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân S. serrata và cẳng chân của chân kẹp (càng); hoa văn Ďa giác xuất hiện rõ ràng trên tất cả các phần phụ Gai thùy trán vừa phải, không nhọn; các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân và cẳng chân của chân kẹp (càng); hoa văn Ďa S. tranquebarica giác xuất hiện ở hai cặp chân cuối cùng, hoa văn này mờ hoặc không có ở các phần phụ khác Gai ở thùy trán hình tam giác, cao vừa phải; Ďôi gai lớn rõ ràng trên cổ chân của càng, trên cẳng chân của chân kẹp S. paramamosain (càng): không có gai phía bên trong, bên ngoài ít gai; hoa (cua xanh, cua sen) văn Ďa giác xuất hiện trên hai cặp chân cuối cùng, hoa văn này mờ hoặc không có ở các phần phụ khác Gai thùy trán thấp và tròn; cặp gai giảm rõ rệt trên cổ chân S. olivacea của càng, trên cẳng chân của chân kẹp (càng): không có gai (cua lửa) phía bên trong và ít gai ở phía ngoài; hoa văn Ďa giác không xuất hiện ở các phần phụ Hình 1.1. Cua Scylla serata Hình 1.2. Cua Scylla tranquebarica
21. 5 Hình 1.3. Cua Scylla paramamosain Hình 1.4. Cua Scylla olivacea Đặc tính sinh học Thời kỳ phát triển, phôi Ďược cua mẹ mang và phát triển ở vùng biển ven bờ, ấu trùng nở ra sống phù du ở Ďây. Cua bột mới nở ra theo thuỷ triều dạt vào vùng nước lợ: những bãi lầy rừng sú vẹt ven bờ biển, cửa sông, nơi có Ďáy bùn, bùn cát hoặc Ďất thịt pha cát mịn giầu mùn bã hữu cơ thuộc vùng trung hạ triều. Cua sinh trưởng ở Ďây cho Ďến lúc thành thục sinh dục thì di cư ra vùng biển gần bờ. Để sinh trưởng và phát triển, cua bùn cũng như tất cả các loài giáp xác khác, khi tích lũy Ďầy Ďủ vật chất và năng lượng Ďều trải qua quá trình lột vỏ Ďể tăng về kích thước. Một chu kỳ lột xác của cua bao gồm 3 giai Ďoạn chính: sau lột xác (postmolt), giữa chu kỳ lột xác (intermolt) và tiền lột xác (premolt). Theo Passano (1960) cũng như Heasman (1980), 3 giai Ďoạn lột xác chính Ďược chia ra thành 10 giai Ďoạn nhỏ hơn là A, B, C1, C2, C3, C4, D1, D2, D3, D4 [6, 7]. Chu kỳ lột xác của cua thay Ďổi theo từng thời gian phát triển, càng về sau thời gian giữa 2 lần lột xác càng kéo dài và chịu tác Ďộng tương tác giữa yếu tố nội sinh và ngoại sinh như nhiệt Ďộ, dinh dưỡng, ánh sáng, giới tính và hormon. Phân bố Các Ďại diện của chi Scylla Ďược tìm thấy sinh sống trong khu vực Ấn Độ Dương - Tây Thái Bình Dương, chủ yếu trong khu vực cửa sông hay các khu vực rừng Ďước [8]. Sự phân bố của từng loài cua trong chi Scylla có sự khác biệt (bảng 1.2). S. serrata có sự phân bố rộng nhất và là loài duy nhất Ďược ghi nhận ở Tây Ấn
22. 6 Độ Dương, Nhật Bản và các Ďảo trên Thái Bình Dương. Hai loài S. tranquebarica và S. olivacea có sự phân bố tập trung ở biển Đông, trải rộng vào Ấn Độ Dương và Tây Thái Bình Dương, trong khi loài S. paramamosain dường như có sự phân bố hẹp hơn nhiều, chủ yếu hạn chế trong khu vực biển Đông và biển Java. Bảng 1.2. Khu vực phân bố của các loài cua bùn Scylla [8] TT Tên loài Khu vực phân bố Ấn Độ Dương-Tây Thái Bình Dương: Nam Phi, biển Đỏ, Australia, Philippines, các Ďảo trên Thái Bình 1 S. serrata Dương (Fiji, quần Ďảo Solomon, New Caledonia, Tây Samoa), Đài Loan, Nhật Bản Ấn Độ Dương: từ Pakistan tới Malaysia; biển Đông: 2 S. tranquebarica Sarawak, Singapore; Thái Bình Dương: Philippines Biển Đông: Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc, Đài 3 S. paramamosain Loan, Hồng Kông, Singapore; biển Java: Kalimantan, Trung Java Ấn Độ Dương: Pakistan tới Malaysia; biển Đông: 4 S. oilvacea Sarawak, Singapore; Thái Bình Dương: Philippines Tại Việt Nam, khi thu mẫu cua ở Ďồng bằng châu thổ sông Mê Công, nhà phân loại học Clive P. Keenan Ďã kết luận: loài cua xanh sống ở khu vực cửa sông Mê Công là loài cua S. paramamosain. Dựa vào bảng tra phân loại của Keenan, Nguyễn Cơ Thạch cho rằng: ở miền Trung có thể có 3 loài cua: S. paramamosain, S. olivacea và S. tranquebarica, nhưng phổ biến là S. paramamosain, chiếm trên 90% trong tổng số 3.000 mẫu cua Ďược phân loại [5]. 1.1.3. Giới thiệu chung về cua lột và nghề nuôi cua lột Cua lột (hay cua mai mềm – Soft-shell crab) là thuật ngữ chỉ cua Ďã lột xác (lột vỏ) tách Ďi bộ mai cứng cũ và bộ mai mới vẫn còn mềm. Trong nghiên cứu này cua lột là chỉ cua bùn (chi Scylla spp.) khi lột bỏ lớp vỏ cứng và chỉ có lớp vỏ mềm (mai mềm) bao bọc cơ thể. Theo Nguyễn Cơ Thạch [5], trong suốt quá trình phát triển tính từ giai Ďoạn cua giống Ďến giai Ďoạn trưởng thành, khoảng thời gian giữa 2 lần lột vỏ tăng dần
23. 7 theo kích thước và trọng lượng. Cua càng lớn thì khoảng thời gian tích lũy vật chất Ďể chuẩn bị cho lần lột vỏ kế tiếp càng kéo dài. Sau mỗi lần lột vỏ, cơ thể tăng cả chiều rộng giáp Ďầu ngực và trọng lượng nhưng thời gian về sau mức Ďộ tăng trưởng về chiều rộng có xu hướng chậm dần so với trọng lượng. Từ cua giống có kích thước chiều rộng giáp Ďầu ngực ban Ďầu là 17,5±1 mm, trọng lượng là 0,7 ± 0,1g Ďến cua Ďạt kích thước thương phẩm khoảng 300 g/con sẽ trải qua 9 lần lột vỏ, tương Ďương 173 ngày. Trước khi cua Ďến ngày lột vỏ thường ăn rất ít hoặc không ăn. Tình hình nuôi cua lột trên thế giới Theo Keenan (1999), có hai hình thức nuôi cua chủ yếu: (1) nuôi từ cua giống lên cua thịt với kích cỡ thương phẩm khoảng 3 – 4 con/kg; (2) nuôi vỗ béo cua lên cua gạch [9]. Cua lột hay còn gọi là cua vỏ mềm (softshell mud crab) Ďã Ďược thu hoạch từ hai hình thức nuôi trên. Tuy nhiên, do nhu cầu thị trường của cua lột tăng lên không ngừng vào cuối những năm 1990 của thế kỷ XX, Ďồng thời giá trị kinh tế của cua lột tăng cao gấp 3 lần so với cua thịt và 2 lần so với cua gạch Ďã thúc Ďẩy nghề nuôi cua lột phát triển khá nhanh, Ďặc biệt ở các nước Đông-Nam Châu Á. Theo báo cáo của Lwin (2011), Thái Lan là nước Ďi Ďầu trong nghề nuôi cua lột [10]. Từ năm 1997, Thái Lan phát triển nuôi cua lột theo phương pháp cắt bỏ chân bò và càng ở 2 tỉnh Samutphakan và Samut Sakhon. Phương pháp này tỷ lệ chết của cua khá cao, khoảng 50%. Năm 2000-2001, một số cơ sở nuôi cua lột của tỉnh Ranong – Thái Lan Ďã tìm ra phương pháp nuôi cua trong từng rổ riêng biệt, nên tỷ lệ chết Ďã giảm xuống 20-30%. Đến năm 2009, tỉnh này Ďã có khoảng 756 trang trại nuôi cua lột hoạt Ďộng với 4.458 ha mặt nước và 20.000 lao Ďộng. Hàng tháng các trang trại ở Ranong Ďã sản xuất Ďược từ 150 tấn Ďến 200 tấn cua lột. Năm 2011, Alber & Julie (2011) Ďã báo cáo nghiên cứu “Hệ thống nuôi cua lột” trên 2 loại hình nuôi phổ biến là nuôi bằng rổ trên giàn bè nổi ở ao/hồ/Ďầm với lưới che hoặc không có lưới che và nuôi bằng rổ trong hệ thống bể nước chảy tuần hoàn có mái che [11]. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc cung cấp oxy hòa tan trong quá trình lọc sinh học giữ vai trò quan trọng. Tác giả cũng Ďã chứng minh mô hình nuôi kết hợp giữa cua lột với cá rô phi hoặc với rong biển Ďã mang lại lợi ích Ďáng kể mà Ďầu tiên phải kể Ďến là môi trường nuôi cua Ďược cải thiện một cách rõ ràng và hiệu quả, tiếp Ďến là Ďa dạng hóa các sản phẩm thu hoạch.