Luận án Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH HỮU ĐÔNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN CHỨA CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CÁ MẬP TRẮNG (CARCHARHINUS DUSSUMIERI) BẰNG ENZYME PROTEASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐINH HỮU ĐÔNG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT ĐẠM THỦY PHÂN CHỨA CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CÁ MẬP TRẮNG (CARCHARHINUS DUSSUMIERI) BẰNG ENZYME PROTEASE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành : Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số : 9540105 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Ngọc Bội PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn KHÁNH HÒA - 2021
3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi. Các số liệu, kết qủa nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào trước đó. Đinh Hữu Đông
4. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo phòng Đào tạo Sau đại học và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho PGS.TS. Vũ Ngọc Bội - Trưởng Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang và PGS. TS. Nguyễn Anh Tuấn - Bộ môn Công nghệ Chế biến Thủy sản đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cám ơn các thầy cô phản biện đã góp ý và cho những lời khuyên quý báu để luận án hoàn thành với chất lượng cao Xin cám ơn Lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm - TP. Hồ Chí Minh đã cho tôi đi học và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Xin gửi lời cám ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập tại trường. Đặc biệt, xin ghi nhớ và tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, chia sẻ khó khăn và động viên tôi để tôi hoàn thành luận án.
5. MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULFATE VÀ ỨNG DỤNG 4 1.2. TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ SỬ DỤNG SỤN CÁ MẬP 12 1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP 14 1.4. GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT SẤY PHUN 17 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 19 2.1.1. Sụn cá mập 19 2.1.2. Enzyme protease 19 2.1.3. Chất mang 20 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1. Các phương pháp nghiên cứu protease và chondroitin sulfate 20 2.2.2. Các phương pháp phân tích hóa học 23 2.2.3. Các phương pháp phân tích cấu trúc 24 2.2.4. Phương pháp định lượng vi sinh vật 24 2.3. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 25 2.3.1. Phương pháp tiếp cận các nội dung nghiên cứu 25 2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số của quá trình nghiên cứu 27 2.4. HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 41 2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 42 i
6. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43 3.1. NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP (C. DUSSUMIERI) BẰNG ENZYME PROTEASE 43 3.1.1. Phân tích thành phần cơ bản của sụn cá mập trắng 43 3.1.2. Xác định loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân 43 3.1.3. Xác định tỷ lệ enzyme alcalase/papain thích hợp cho quá trình thủy phân 50 3.1.4. Xác định nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase - papain thích hợp cho quá trình thủy phân 56 3.1.5. Xác định tỷ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân 63 3.1.6. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân 69 3.1.7. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân 76 3.1.8. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân 83 3.1.9. Tối ưu hóa quá trình thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase-papain87 3.1.10. Đề xuất quy trình thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase papain 95 3.2. ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DỊCH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG HỖN HỢP ENZYME ALCALASE - PAPAIN VÀ PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA CHONDROITIN SULFATE 97 3.2.1. Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập 97 3.2.2. Phân tích cấu trúc chondroitin sulfate có trong dịch thủy phân sụn cá mập 100 3.3. NGHIÊN CỨU SẤY PHUN TẠO BỘT ĐẠM THỦY PHÂN CHỨA CHONDROITIN SULFATE 121 3.3.1. Xác định chất mang thích hợp cho quá trình sấy phun 121 3.3.2. Xác định tỉ lệ chất mang thích hợp cho quá trình sấy phun 124 3.3.3. Xác định nhiệt độ không khí buồng sấy thích hợp 125 3.3.4. Xác định tốc độ bơm nhập liệu 128 3.3.5. Xác định áp suất buồng sấy 130 3.3.6. Tối ưu hóa quá trình sấy phun tạo bột đạm chứa chondroitin sulfate từ dịch thủy phân sụn cá mập 133 ii
7. 3.3.7. Đề xuất quy trình sản xuất và đánh giá chất lượng bột đạm chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập 139 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 143 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 145 TÀI LIỆU THAM KHẢO 146 PHỤ LỤC iii
8. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Naa : Hàm lượng nitơ acid amin NNH3 : Nitơ NH3. NTS : Nitơ tổng số pHopt : pH thích hợp. topt : Nhiệt độ thích hợp V : Thể tích. E : Enzyme [E] : Nồng độ enzyme GAG : Glycosaminoglycan GalNAc : N-acetyl-D- galactosamine GlcA : D-glucuronic acid CS : Chondroitin sulfate CTAB : Cetyltrimethylamnonium bromide CS4 : Chondroitin-4-sulphate (dermatant sulphate) CS6 : Chondroitin-6-sulphate CPC : Cetylpyridium chloride HPLC : (High Performance Liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao FT-IR : (Fourrier Transformation InfraRed) Quang phổ hồng ngoại COSY : (Correlation Spectroscopy) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều COSY HSQC :(Heteronuclear Single Quantum Cohenrence) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC : (Heteronuclear Muntiple-Bond Correlation) Phổ cộng hưởng HMBC từ hạt nhân 2 chiều HMBC : (Nuclear Magnetic Resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1 chiều NMR iv
9. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại chondroitin sulfate 7 Bảng 1.2. Hàm lượng chondroitin sulfate của một số loại sụn động vật 9 Bảng 2.1. Mã hóa biến nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian thủy phân và các mức độ khảo sát 34 Bảng 2.2. Mã hóa biến nhiệt độ buồng sấy, tỷ lệ maltodextrin bổ sung, tốc độ nhập liệu và các mức độ khảo sát 40 Bảng 3.1. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa học cơ bản của sụn cá mập trắng 43 Bảng 3.2. Bảng ma trận thực nghiệm ảnh hưởng của biến mã hóa tới hiệu suất thủy phân tạo chondroitin sulfate 88 Bảng 3.3. Kết quả phân tích phương sai và hệ số tuyến tính, tương tác và bình phương của các phương trình hồi quy để dự đoán mức độ ảnh hưởng của các nhân tố thủy phân đến hàm mục tiêu 89 Bảng 3.4. Thành phần hóa học và năng lượng của dịch thủy phân sụn cá mập 98 Bảng 3.5. Trạng thái cảm quan của dịch thủy phân 99 Bảng 3.6. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh của dịch thủy phân sụn cá mập 99 Bảng 3.7. Bảng gắn các tín hiệu dị nhân proton H/C trên phổ HSQC 107 Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm và kết quả qui hoạch trực tâm quay (RCCD) của hàm mục tiêu Y (hiệu suất thu chondroitin sulfate) theo biến nhiệt độ buồng sấy (X4), tỷ lệ maltodextrin (X5) và tốc độ nhập liệu (X6) 133 Bảng 3.9. Kết quả phân tích phương sai và hệ số tuyến tính, tương tác và bình phương của các phương trình hồi quy để dự đoán mức độ ảnh hưởng của các nhân tố sấy đến hàm mục tiêu 137 Bảng 3.10. Kết quả tối ưu hóa hiệu suất thu chondroitin sulfate theo biến X4, X5, X6 . 137 Bảng 3.11. Giá trị tối ưu của hàm mục tiêu hiệu suất thu chondroitin sulfate theo nhiệt độ, tỷ lệ maltodextrin và tốc độ nhập liệu tìm được từ mô hình dự đoán 138 Bảng 3.12. Kết quả một số chỉ tiêu hóa học của bột đạm thủy phân 141 Bảng 3.13. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh của bột đạm chứa chondroitin sulfate . 141 v
10. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi chondroitin sulfate 5 Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các chondroitin sulfate 5 Hình 1.3. Cấu trúc một đơn vị của chondroitin sulfate A 6 Hình 1.4. Cấu trúc của chondroitin sulfate B 6 Hình 1.5. Cấu trúc của chondroitin sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S ) - CS6 6 Hình 1.5. Hình ảnh về một số sản phẩm từ sụn cá mập 14 Hình 2.1. Hình ảnh sụn cá mập trước và sau khi xử lý 19 Hình 2.2. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu 25 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm lựa chọn loại enzyme proetase thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập 27 Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập 28 Hình 2.5. Sơ đồ thí nghiệm xác định nồng độ hỗn hợp enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập 29 Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm xác định tỉ lệ nước bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập 30 Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập 31 Hình 2.8. Sơ đồ thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập 32 Hình 2.9. Sơ đồ thí nghiệm xác định biên thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập 33 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại chất mang phù hợp 36 Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ chất mang bổ sung 37 Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ buồng sấy thích hợp 38 Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định áp suất buồng sấy thích hợp 39 Hình 2.14. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tốc độ nhập liệu thích hợp 40 Hình 3.1. Sự thay đổi của hàm lượng protein theo thời gian thủy phân và loại enzyme vi
11. protease 44 Hình 3.2. Sự thay đổi của hàm lượng peptid theo thời gian thủy phân và loại enzyme protease 44 Hình 3.3. Sự thay đổi của hàm lượng Naa theo thời gian thủy phân và loại enzyme protease 45 Hình 3.4. Sự thay đổi của hàm lượng chondroitin sulfate theo thời gian thủy phân và loại enzyme protease 45 Hình 3.5. Sự thay đổi của hàm lượng NNH3 theo thời gian thủy phân và loại enzyme protease 46 Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và tỷ lệ alcalase/papain đến hàm lượng protein tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 51 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và tỷ lệ alcalase/papain đến hàm lượng peptid tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 51 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và tỷ lệ alcalase/papain đến hàm lượng Naa tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 52 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và tỷ lệ alcalase/papain đến hàm lượng chondroitin sulfate tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 52 Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và tỷ lệ alcalase/papain đến hàm lượng NNH3 tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 53 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 57 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng peptid tạo thành trong dịch thủy phân 57 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng Naa tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 58 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng chondroitin sulfate tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 58 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp enzyme alcalase-papain và thời gian thủy phân đến hàm lượng NNH3 tạo thành trong dịch thủy phân sụn cá mập 59 Hình 3.16. Ảnh hưởng của tỉ lệ sụn/nước bổ sung và thời gian thủy phân đến hàm lượng vii
12. protein hòa tan của dịch thủy phân sụn cá mập 65 Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỉ lệ sụn/nước bổ sung và thời gian thủy phân đến hàm lượng peptid của dịch thủy phân sụn cá mập 65 Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỉ lệ sụn/nước bổ sung và thời gian thủy phân đến hàm lượng Naa của dịch thủy phân sụn cá mập 66 Hình 3.19. Ảnh hưởng của tỉ lệ sụn/nước bổ sung và thời gian thủy phân đến hàm lượng chondroitin sulfate của dịch thủy phân sụn cá mập 66 Hình 3.20. Ảnh hưởng của tỉ lệ sụn/nước bổ sung và thời gian thủy phân đến hàm lượng NNH3 của dịch thủy phân sụn cá mập 67 Hình 3.21. Ảnh hưởng của pH và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân sụn cá mập 71 Hình 3.22. Ảnh hưởng của pH và thời gian thủy phân đến hàm lượng peptid của dịch thủy phân sụn cá mập 72 Hình 3.23. Ảnh hưởng của pH và thời gian thủy phân đến hàm lượng Naa của dịch thủy phân sụn cá mập 72 Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH và thời gian thủy phân đến hàm lượng chondroitin sulfate của dịch thủy phân sụn cá mập 73 Hình 3.25. Ảnh hưởng của pH và thời gian thủy phân đến hàm lượng NNH3 của dịch thủy phân sụn cá mập 73 Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân sụn cá mập 78 Hình 3.27. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng peptid của dịch thủy phân sụn cá mập 78 Hình 3.28. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng Naa của dịch thủy phân sụn cá mập 79 Hình 3.29. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng chondroitin sulfate của dịch thủy phân sụn cá mập 79 Hình 3.30. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng NNH3 của dịch thủy phân sụn cá mập 80 Hình 3.31. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch viii
13. thủy phân sụn cá mập 83 Hình 3.32. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng peptid trong dịch thủy phân sụn cá mập 84 Hình 3.33. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng Naa trong dịch thủy phân sụn cá mập 84 Hình 3.34. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng chondroitin sulfate trong dịch thủy phân sụn cá mập 84 Hình 3.35. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng NNH3 trong dịch thủy phân sụn cá mập 85 Hình 3.36. Mối tương quan giữa mô hình dự đoán và thực nghiệm của các biến độc lập tới hiệu suất thủy phân tạo chondroitin sulfate cao 89 Hình 3.37. Sự thiếu phù hợp của mô hình thông qua chỉ số (lack of fit >0,05) 90 Hình 3.38. Bề mặt đáp ứng thể hiện mối tương quan giữa nồng độ enzyme (X1) và nhiệt độ (X2) đến hiệu suất thủy phân thu chondroitin sulfate 92 Hình 3.39. Bề mặt đáp ứng thể hiện mối tương quan giữa nồng độ enzyme (X1) và thời gian (X3) đến hiệu suất thủy phân tạo chondroitin sulfate cao 92 Hình 3.40. Bề mặt đáp ứng thể hiện mối tương quan giữa nhiệt độ (X2) và thời gian (X3) đến hiệu suất thủy phân tạo chondroitin sulfate cao 92 Hình 3.41. Mối tương quan giữa mô hình lý thuyết và thực nghiệm của các nhân tố thủy phân đến quá trình thủy phân tạo chondroitin sulfate 95 Hình 3.42. Sơ đồ quy trình thủy phân sụn cá mập bằng hỗn hợp enzyme alcalase - papain 96 Hình 3.43. Hình ảnh về dịch thủy phân sụn cá mập 97 Hình 3.44. Kết quả xác định các nhóm chức của chondroitin sulfate có trong dịch thủy phân sụn cá mập dựa vào phổ FT-IR 100 Hình 3.45. Dự đoán nhóm chức trong cấu trúc chondroitin sulfate từ sụn cá mập 101 Hình 3.46. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate thu được bằng phổ 1H-NMR với độ dịch chuyển hóa học proton từ 0ppm ÷ 5,5ppm 103 Hình 3.47. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate thu được bằng phổ 1H-NMR với ix
14. độ dịch chuyển hóa học proton từ 2,9ppm ÷ 4,9ppm 104 Hình 3.48. Phổ 13C-NMR của chondroitin sulfate có trong dịch thủy phân từ sụn cá mập 105 Hình 3.49. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate thu được bằng phổ 13C-NMR với độ dịch chuyển hóa học proton từ 50ppm ÷ 105ppm 106 Hình 3.50. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate thu được bằng phổ 13C-NMR với độ dịch chuyển hóa học proton từ 67ppm ÷ 82ppm 106 Hình 3.51. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HSQC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 4.3 ÷5.3ppm và C từ 76 ÷ 106ppm 109 Hình 3.52. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HSQC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 3,1 ÷ 4,5ppm và C từ 50 ÷ 85ppm 110 Hình 3.53. Cấu trúc chondroitin sulfate có trong dịch thủy phân từ sụn cá mập 112 Hình 3.54. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ COSY với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 1,0 ÷ 5,5ppm và C từ 1,0 ÷ 5,5ppm 113 Hình 3.55. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HSQC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 3,1 ÷ 5,4ppm và C từ 3,1 ÷ 5,3ppm 113 Hình 3.56. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HSQC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 3,2 ÷ 4,8ppm và C từ 3,2 ÷ 4,8ppm 114 Hình 3.57. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HMBC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 1,7 ÷ 5,5ppm và C từ 10 ÷ 200ppm 116 Hình 3.58. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HMBC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 3,1 ÷ 5,4ppm và C từ 40 ÷ 110ppm 117 Hình 3.59. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HMBC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 3,4 ÷ 4,7ppm và C từ 50 ÷ 85ppm 118 Hình 3.60. Tín hiệu cấu trúc mảnh chondroitin sulfate bằng phổ HMBC với độ dịch chuyển hóa học proton của H từ 3,2 ÷ 4,0ppm và C từ 60 ÷ 105ppm 119 Hình 3.61. Cấu trúc chondroitin sulfate có trong dịch thủy phân sụn cá mập 121 Hình 3.62. Ảnh hưởng của chất mang đến hàm lượng nitơ tổng của bột đạm 122 Hình 3.63. Ảnh hưởng của loại chất mang đến hàm lượng chondroitin sulfate của bột x
15. đạm 122 Hình 3.64. Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hiệu suất thu hồi bột đạm 122 Hình 3.65. Ảnh hưởng của tỉ lệ maltodextrin sử dụng đến hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate 124 Hình 3.66. Ảnh hưởng của tỉ lệ maltodextrin sử dụng đến hiệu suất thu hồi bột đạm 125 Hình 3.67. Ảnh hưởng của nhiệt độ buồng sấy đến hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate 126 Hình 3.68. Ảnh hưởng của nhiệt độ buồng sấy đến hiệu suất thu hồi bột đạm 126 Hình 3.69. Ảnh hưởng của nhiệt độ buồng sấy đến độ ẩm của bột đạm 126 Hình 3.70. Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate 128 Hình 3.71. Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến hiệu suất thu hồi bột đạm 129 Hình 3.72. Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến độ ẩm bột đạm sau sấy 129 Hình 3.73. Ảnh hưởng của áp suất buồng sấy đến hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate 131 Hình 3.74. Ảnh hưởng của áp suất buồng sấy đến hiệu suất thu hồi bột đạm 131 Hình 3.75. Ảnh hưởng của áp suất buồng sấy đến độ ẩm của bột đạm 131 Hình 3.76. Bề mặt đáp ứng thể hiện mối tương quan giữa nhiệt độ buồng sấy (X4) và tỷ lệ maltodextrin (X5) đến hiệu suất thu chondroitin sulfate 134 Hình 3.77. Bề mặt đáp ứng thể hiện mối tương quan giữa nhiệt độ buồng sấy (X4) và tốc độ nhập liệu (X6) đến hiệu suất thu chondroitin sulfate 135 Hình 3.78. Bề mặt đáp ứng thể hiện mối tương quan giữa tỷ lệ maltodextrin (X5) và tốc độ nhập liệu (X6) đến hiệu suất thu chondroitin sulfate 135 Hình 3.79. Mối tương quan giữa mô hình lý thuyết và thực nghiệm của các nhân tố sấy đến quá trình sấy phun tạo bột đạm từ dịch thủy phân sụn cá mập 138 Hình 3.80. Sơ đồ quy trình quy trình sản xuất bột đạm chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng bằng enzyme protease 139 Hình 3.81. Giản đồ phân tích nhiệt vi sai của bột đạm chứa chondroitin sulfate 141 xi
16. TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: Đinh Hữu Đông. Khóa: 2014 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Vũ Ngọc Bội 2. PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu thủy phân và tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập (C. dussumieri) định hướng ứng dụng trong thực phẩm chức năng: 1) Xác định được các thông số tối ưu cho quá trình thuỷ phân sụn cá mập là: tổ hợp enzyme Alcalase: Papain với tỷ lệ 60/40, nồng độ 0,3%; Tỷ lệ nguyên liệu:nước là 1/1; pH thích hợp là 6,8; nhiệt độ thuỷ phân là 50oC trong thời gian 20 giờ. Hiệu suất thu hồi chondritin sulfate là 96,97%. Dịch đạm thuỷ phân có năng lượng dinh dưỡng: 20,42 Kcal/100 ml, hàm lượng chondroitin sulfate: 40,5 mg/ml, Nitơ tổng số: 7,46 g/l, khoáng tổng số: 3,02 g/l, Zn: 7,63 mg/l, Mg: 205 mg/l, Fe: 4,78 mg/l, dịch có chứa 18 loại acid amin và đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế. 2) Xác định được cấu trúc đặc trưng bảo toàn cả hai gốc sulfate C4 và C6 của sản phẩm chondroitin sulfate. Sản phẩm là hỗn hợp gồm 2 đồng phân GlcA-GalNAc-4SO3- và GlcA-GalNAc-6SO3-. 3) Xác định được các thông số tối ưu cho quá trình sấy phun tạo bột đạm chứa chondroitin sulfate từ dịch thuỷ phân sụn cá mập là: 12% chất mang maltodextrin, nhiệt độ buồng sấy là 80oC, tốc độ dòng 12 ml/phút và áp suất buồng sấy 2,5bar. Hiệu suất thu hồi chondroitin sulfate là 87,81%. Sản phẩm có hàm lượng chondroitin sulfate là 203mg/g, nito tổng số 5,04g/100g, tro tổng số 3,95g/100g, độ ẩm 4,27% và đạt tiêu chuẩn vi sinh vật dùng trong thực phẩm theo qui định của Bộ Y tế. xii
17. 4) Xác định được qui trình sản xuất bột đạm thuỷ phân chứa chondroitin sulfate từ dịch thủy phân sụn cá mập tươi bằng enzyme protease ở quy mô thí nghiệm. Sản phẩm bột đạm chứa chondroitin sulfate đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm theo quy định hiện hành của Bộ Y tế. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH PGS.TS. Vũ Ngọc Bội PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn Đinh Hữu Đông xiii
18. MỞ ĐẦU Chondroitin sulfate là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp và các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng ) giúp cho sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép. Chondroitin sulfate cũng làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo sự vận động linh hoạt của khớp [21, 23]. Chondroitin sulfate còn có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng cách ức chế các enzyme phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N-acetylglucosamindase. Vì vậy, chondroitin sulfate được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp và hạn chế quá trình thoái hoá sụn khớp. Ngoài ra, chondroitin sulfate cũng góp phần nuôi duỡng và tái tạo các tế bào của giác mạc mắt [21, 23, 39]. Chondroitin sulfate chủ yếu được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên, trong đó, có sụn cá mà đặc biệt là sụn cá mập do sụn cá mập thường có hàm lượng chondroitin sulphat cao hơn sụn các loại động vật khác [21, 39]. Chính vì thế, người ta thường sử dụng sụn cá mập dưới dạng bột khô trong sản xuất viên nén thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các bệnh xương khớp [39, 43, 47÷49]. Tuy thế, trong sụn cá mập, chondroitin sulfate thường liên kết với protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành phức hợp proteoglycan (glucoprotein) nằm trong cấu trúc của mô sụn nên con người rất khó hấp thụ [21, 23, 24, 63]. Hiện có một số nghiên cứu sử dụng tác nhân hóa học hoặc enzyme thủy phân sụn cá khô hoặc tươi sau đó kết tủa thu chondroitin sulfate dùng trong sản xuất thực phẩm chức năng [23, 39, 42, 63÷70]. Tuy vậy, việc chỉ thu nhận chondroitin sulfate dẫn đến sự lãng phí các chất tự nhiên từ sụn cá và hiệu quả sử dụng trong điều trị các bệnh lý về xương khớp không cao cũng như giá thành sản phẩm cao nên hiệu quả hạn chế [23, 39, 42, 44, 45, 63÷70]. Để khắc phục hiện tượng này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sử dụng enzyme trong thủy phân sụn cá mập tươi với mong muốn tạo ra dịch thủy phân chứa các chất tự nhiên từ sụn cá và chondroitin sulphat để định hướng sử dụng làm thực phẩm chức năng cung cấp các thành phần thiết yếu giúp hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp và chống thoái hóa xương khớp. Việt Nam có bờ biển dài hơn 3260km, sản lượng khai thác thủy sản lớn và trong quá trình khai thác thủy sản, số lượng cá mập mắc lưới khá lớn [14, 23, 26, 27]. Hiện cá mập được người dân sử dụng để thu cước cá phần còn lại chiếm tỷ trọng lớn là sụn cá 1
19. và vi cá thường phơi khô bán cho thương lái Trung Quốc với giá rẻ [38]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thủy phân sụn sụn cá mập tươi còn rất mới mẻ và chưa có một công trình nào đề cập đến vấn đề này. Do vậy, Luận án tiến hành: “Nghiên cứu sản xuất bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate từ sụn cá mập trắng (Carcharhinus dussumieri) bằng enzyme protease”. Mục đích của luận án: Tận dụng nguồn nguyên liệu còn lại - sụn cá mập tươi trong chế biến tạo dịch thủy phân và bột đạm chứa chondroitin sulfate và các chất tự nhiên từ sụn cá mập (C. dussumieri) bằng công nghệ sử dụng enzyme protease thân thiện với môi trường để định hướng sử dụng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị chống thoái hóa xương khớp. Nội dung nghiên cứu của luận án: 1) Nghiên cứu thủy phân sụn cá mập (C. dussumieri) bằng enzyme protease. 2) Đánh giá chất lượng dịch thủy phân sụn cá mập và xác định cấu trúc chondroitin sulfate. 3) Nghiên cứu sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate. Ý nghĩa khoa học của luận án: Luận án lần đầu tiên tiến hành nghiên cứu một cách toàn diện từ công đoạn thủy phân sụn cá mập tươi, cho tới nghiên cứu sấy khô tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate. Do vậy luận án có ý nghĩa về khoa học, thể hiện ở chỗ đã chứng minh rằng có thể thủy phân sụn cá mập bằng tổ hợp enzyme protease và thu dịch thủy phân chứa các chất dinh dưỡng từ sụn cá mập để ứng dụng trong thực phẩm và sấy phun tạo bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate, đây một sản phẩm hoàn toàn mới trước đây chưa có ai nghiên cứu. Mặt khác các số liệu nghiên cứu của luận án là thông tin khoa học có giá trị và tài liệu tham khảo phục vụ cho việc giảng dạy, các học viên cao học và nghiên cứu sinh quan tâm tới lĩnh vực này. Ý nghĩa thực tiễn của luận án: Luận án lần đầu tiên tạo ra dịch thủy phân sụn cá mập và sản phẩm bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate, dễ hấp thụ và tiện lợi khi sử dụng làm thực phẩm chức năng. Đặc biệt sản phẩm bột đạm thủy phân chứa chondroitin sulfate thích hợp cho 2
20. những người bị bệnh về xương khớp, hơn nữa sản phẩm khô dễ bảo quản và vận chuyển. Do vậy, luận án có ý nghĩa thực tiễn cao là cơ sở cho việc định hướng sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị chống thoái hóa xương khớp. 3
21. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULFATE VÀ ỨNG DỤNG 1.1.1. Cấu trúc chondroitin sulfate Chondroitin sulfate (CS) là một polysaccharid, thuộc nhóm heteropolysaccharid gọi là glycosaminoglycan (GAG), được tìm thấy trong tự nhiên ở dạng một polyme mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản được cấu tạo bởi 2 loại đường là N-acetyl-D- galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric D- galactosamine and D-glucuronic acid). Các gốc đường này có thể được sulphate hóa hay không bị sulphate hoá [23, 63], một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA). Chondroitin sulfate là một polyme tự nhiên có chứa 15÷150 đơn vị cấu trúc của đơn vị cơ bản gồm 2 loại đường là GlcA và GalNAc. Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng 10.000 ÷ 100.000 Dalton [23, 37, 57, 65, 79, 84, 85]. Năm 1950, Julia Einbinder và Maxwell Schubert lần đầu tiên phát hiện và tách chiết được chondroitin sulfate từ sụn bằng cách kỹ thuật chiết rút chondroitin sulfate trong dung dịch natri hydroxit 2%. Sau đó, Julia Einbinder và Maxwell Schubert đã tinh sạch được chondroitin sulfate bằng cách sử dụng canxi clorua khử protein ra khỏi dịch chiết, thu được chondroitin sulfate [65]. Năm 1986, Farndale W. R., Buttle D. J. và Barrett A. J. công bố nghiên cứu về CS và cho rằng CS thường gắn với các protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một phức chất proteoglycan (PG) (glucoprotein) - là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharid [56, 57, 65, 81, 84, 85]. 2- Sự kết hợp giữa nhóm sulphate (SO4 ) với các nhóm carboxyl (COO-) làm cho phân tử chondroitin sulfate có mật độ điện tích âm rất cao dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG. Trong cấu trúc của proteoglycan, CS thường gắn với nhóm OH của acid amin serine nằm trong chuỗi polypeptid của protein. Các nhà khoa học vẫn chưa biết được cách protein gắn chọn lọc chính xác với GAG. Tuy thế, họ cho rằng GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết của chuỗi GAG với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-Gal-Gal-GlcA trong đó xylose gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgi [45, 48, 79]. 4
22. Chondroitin sulfate là polyme ưa nước vì thế mô sụn có hàm lượng nước cao. Phân tử đường trong cấu trúc của CS có thể không bị sulphate hoá, bị sulphate hoá 1 lần hay 2 lần, đa phần nhóm OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulphate hoá, đối với một số chuỗi GAG có thể bị sulphate hoá ở vị trí 2 của GlcA. Quá trình sulphate hoá là nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulphate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù cho CS [39, 45, 48÷50]. Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động enzyme và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào [39, 45, 48÷50]. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng 80÷100 mạch CS) cùng với protein và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thủy động học có khả năng nén thuận nghịch giúp cho mô sụn chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [38]. Công thức và cấu trúc hoá học của một đơn vị trong cấu trúc của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n được trình bày ở hình 1.1 và 1.2. Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi chondroitin sulfate [23,56] Chondroitin-4-sulphate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H. Chondroitin-6-sulphate: R1 = SO3H; R2, R3 = H. Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các chondroitin sulfate [23, 56] 5
23. Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C được đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm sulphate trong disaccharid lặp lại của chuỗi polysaccharid. Chondroitin sulfate A: gốc sulphate gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulphate, GlcA-GalNAc-4S, CS4) (Hình 1.3), kết hợp với protein tạo nên chondromucoid và có nhiều ở mô sụn. Chondroitin sulfate C: gốc sulphate gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulphate, CS6). Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S, CS4): acid iduronic thay thế acid glucuronic (hình 1.4). CS4 còn được gọi là dermatant sulphate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường có nhiều ở da, ngoài ra còn gặp ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị sulphate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid [23, 56] . Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) thường được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối, ) [56, 63, 81, 88, 94]. Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa nhiều hay ít các isome của CS, có tới 16 isome của CS, phụ thuộc vào vị trí sulphate hóa của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/ mỗi cặp. Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG. Hình 1.3. Cấu trúc một đơn vị của Hình 1.4. Cấu trúc của chondroitin chondroitin sulfate A sulfate B Hình 1.5. Cấu trúc của chondroitin sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S) - CS6 Người ta tách chiết được CS trước khi cấu trúc của nó được xác định. Do vậy, tên gọi của CS cũng có sự thay đổi. Phân loại CS được tóm tắt trong bảng 1.1. 6