Luận án Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NCS. Lê Thị Thơm NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NCS. Lê Thị Thơm Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI” Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS. Đặng Diễm Hồng Hà Nội – 2021
3. i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, chỉ bảo tận tình những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ về tinh thần, vật chất, động viên tôi vượt qua nhiều trở ngại và khó khăn để hoàn thành luận án trong suốt những năm qua. Tôi trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng đào tạo của học Viện Khoa học và Công nghệ cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang công tác tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS. Hoàng Thị Lan Anh, TS. Lưu Thị Tâm, TS. Nguyễn Cẩm Hà, ThS. Đinh Thị Ngọc Mai . đã cho tôi những lời khuyên chân thành, đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh số liệu trong luận án này. Tôi xin cảm ơn Khoa Dược lý – Học viện Quân Y đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, TS. Đoàn Lan Phương – Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên - phân tích hàm lượng các axít béo, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - kiểm tra chất lượng của dầu, Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco - bao viên, đóng gói và hoàn thiện sản phẩm. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Công Thương “Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng” năm 2013 - 2015 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 do PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 20 Nghiên cứu sinh Lê Thị Thơm
4. ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 20 Tác giả Lê Thị Thơm
5. iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo 4 1.1.1. Giới thiệu chung về axit béo . 4 1.1.2. Vai trò và ứng dụng của PUFAs . 6 1.1.3. Nguồn cung cấp PUFAs 9 1.1.4. Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở vi tảo 14 1.2. Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối và các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi sinh khối . 18 1.2.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Schizochytrium 18 1.2.2. Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng trên thế giới 20 1.2.3. Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium trên các quy mô khác nhau và sản xuất thương mại DHA 22 1.2.4. Một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sản xuất DHA ở thraustochytrid, đặc biệt là chi Schizochytrium 24 1.3. Các phương pháp tách chiết, tinh sạch PUFAs, bảo quản dầu 26 1.3.1. Các phương pháp tách chiết dầu thô có chứa PUFAs . . 26 1.3.2. Các phương pháp thủy phân dầu từ dầu thô . 29 1.3.3. Các phương pháp tinh sạch PUFAs, DHA, EPA, DPA 30 1.3.4. Bảo quản axit béo . 33 1.4. Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của dầu tách chiết từ Schizochutrium đối với người và động vật . 35 1.5. Tình hình sản xuất và tách chiết PUFAs từ VTBDD ở Việt Nam 36 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 38 2.1. Vật liệu 38 2.1.1. Chủng tảo và điều kiện nhân nuôi sinh khối 38 2.1.2. Động vật thí nghiệm 38 2.1.3. Sinh khối tảo và cặp mồi đặc hiệu 38 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu 39 2.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng 39 2.2.1. Hóa chất 39 2.2.2. Các dụng cụ và thiết bị sử dụng . 39 2.3. Môi trường 40
6. iv 2.4. Phương pháp nghiên cứu 41 2.4.1. Sàng lọc và nhân nuôi sinh khối chủng tiềm năng trong các hệ thống lên men khác nhau cho tích lũy các axit béo ω 3 - 6 cao 41 2.4.2. Phương pháp tách chiết lipit và làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω 3 - 6 44 2.4.3. Xác định các chỉ tiêu chất lượng của dầu . 47 2.4.4. Tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên Algal oil omega 3 (AOO-3-6) 50 2.5. Bố trí thí nghiệm 51 2.5.1. Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo ω 3 - 6 51 2.5.2. Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng tiềm năng 52 2.5.3. Nhân nuôi sinh khối chủng S. mangrovei TB17 trong các hệ thống lên men khác nhau (1, 5, 10, 30 và 150 Lít) . 52 2.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện đến quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 54 2.5.5. Nghiên cứu khả năng bảo quản của các chất chống oxy hóa lên chất lượng dầu sinh học omega-3 và omega-6 57 2.5.6. Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6 57 2.6. Xử lý số liệu 58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 3.1. Sàng lọc chủng/loài tiềm năng và lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp ở các quy mô khác nhau 59 3.1.1. Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm năng cho sản xuất sinh khối giàu axit béo omega 3 - 6 . 59 3.1.2. Lựa chọn điều kiện nhân nuôi sinh khối thích hợp chủng TB17 ở quy mô bình tam giác lên sinh trưởng và tích lũy axit béo 62 3.1.3. Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 5 và 10 Lít 68 3.1.4. Nhân nuôi sinh khối ở hệ thống lên men 30 Lít . 70 3.1.5. Nhân nuôi sinh khối ở các hệ thống lên men 150 Lít . 72 3.1.6. Các phương pháp nhân nuôi khác nhau để cung cấp sinh khối giàu axít béo ω 3 – 6 74 3.1.7. Thu hoạch sinh khối chủng S. mangrovei TB17 80 3.2. Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ SKK chủng TB17 82 3.2.1. Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng FFA 82 3.2.2. Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 dạng methyl este 94 3.2.3. So sánh 2 phương pháp tách chiết dầu (dạng FFA và dạng methyl ester) từ
7. v sinh khối tươi và SKK 100 3.2.4. Sản xuất và đánh giá chất lượng dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 ở quy mô 100g SKK/mẻ 103 3.3. Các điều kiện bảo quản dầu, sản xuất viên nang mềm và đánh giá tính an toàn, tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên nang mềm AOO-3-6 108 3.3.1. Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa đến quá trình bảo quản dầu giàu các axit béo ω 3 - 6 108 3.3.2. Nghiên cứu sản xuất viên nang mềm algal oil omega 3 - 6 từ dầu sinh học giàu axit béo ω 3 – 6 113 3.3.3. Nghiên cứu tính an toàn và tác dụng tăng cường trí nhớ, khả năng học tập của viên dầu tảo AOO-3-6 116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 124 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO 127 PHỤ LỤC
8. vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ALA α-linolenic acid Axit α-linolenic AOO-3-6 Algal oil omega-3-6 ARA Arachidonic acid Axit Arachidonic BHA Butylated Hydroxyanisole Butylated Hydroxyanisole BHT Butylated Hydroxytoluene Butylated Hydroxytoluene CCT Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng CNMTK Cao nấm men tinh khiết CNMCN Cao nấm men công nghiệp DHA Docosahexaenoic acid Axit Docosahexaenoic DPA Docosapentaenoic acid Axit Docosapentaenoic DGLA dihomo-gamma-linoleic acid Axit dihomo-gamma-linoleic EE Ethyl este Ethyl este EPA Eicosapentaenoic acid Axit Eicosapentaenoic FFA Free Fatty acid Axit béo tự do FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kỳ GRAS Generally Recognized as Safe Chứng nhận là an toàn GLA Gama linoleic acid Axit Gama linoleic LA Linoleic acid Axit Linoleic MĐTB Mật độ tế bào MUFA Monounsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa một nối đôi MP Melting point Điểm nóng chảy NTTS Nuôi trồng thủy sản PL Phospholipid Phospholipid PUFA Polyunsaturated fatty acid Axit béo không bão hòa đa nối đôi PKS Polyketide synthase Sinh tổng hợp kỵ khí PG Propyl Gallate Propyl Gallate SFA Saturated fatty acid Axit béo bão hòa SKT Sinh khối tươi SKK Sinh khối khô TEM Transmission electron Kính hiển vi điện tử truyền qua microscopy TFA Total fatty acid Axit béo tổng số TAG Triacylglycerol Triacylglycerol TG Triglyceride Triglyceride TLCT Trọng lượng cơ thể TBHQ Tertiary Butyl Hydroquinone Tertiary Butyl Hydroquinone VTB Vi tảo biển VTBDD Vi tảo biển dị dưỡng VKTQH Vi khuẩn tía quang hợp ω - 3 Omega 3 Omega 3 ω - 6 Omega 6 Omega 6 ω 3 - 6 Omega 3 - 6 Omega 3 - 6
9. vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng các axít béo ω 3 - 6 có trong một số loại dầu thực vật 9 Bảng 1.2 Hàm lượng DHA và EPA của một số loại cá và động vật 10 Bảng 1.3 Một số sản phẩm thương mại có chứa EPA và DHA có nguồn gốc từ vi tảo . 24 Bảng 1.4 Một số phương pháp tách chiết dầu và khả năng thu hồi của chúng 29 Bảng 2.1 Danh sách các chủng VTBDD Schizochytrium spp. 38 Bảng 3.1 Sự thay đổi MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của các chủng được nhân nuôi sinh khối trong bình tam giác 250 mL sau 144 giờ 60 Bảng 3.2 Thành phần axit béo của các chủng TG11(6), TB17 và PQ6 61 Bảng 3.3 Thành phần axit béo trong sinh khối tươi của chủng TB17 nhân nuôi sinh khối trong bình tam giác 1 Lit . 67 Bảng 3.4 Thành phần axít béo của sinh khối tươi chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 5 và 10 Lít 69 Bảng 3.5 Thay đổi MĐTB, SKK, hàm lượng lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 70 Bảng 3.6 Thành phần và hàm lượng axít béo của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 30 Lít sử dụng CNMTK và CNMCN 71 Bảng 3.7 Thay đổi mật độ tế bào, sinh khối khô và lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít 72 Bảng 3.8 Thành phần và hàm lượng axít béo của sinh khối tảo S. mangrovei TB17 sau 120 giờ nhân nuôi sinh khối trong hệ thống lên men 150 Lít 73 Bảng 3.9 Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo mẻ . 75 Bảng 3.10 Sinh trưởng, hàm lượng lipit và glucose dư trong môi trường của chủng TB17 dưới điều kiện nhân nuôi sinh khối theo kiểu fed-batch 75 Bảng 3.11 Thành phần axit béo trong sinh khối của chủng TB17 ở các phương pháp nhân nuôi sinh khối khác nhau trong môi trường P1 77 Bảng 3.12 Tổng hợp thành phần và hàm lượng các axit béo chủ yếu trong quá trình nhân nuôi sinh khối ở các quy mô khác nhau 79 Bảng 3.13 Thành phần axít béo trong lipit của chủng TB17 khi nhân nuôi sinh khối theo mẻ ở hệ thống lên men 30 Lít . 86 Bảng 3.14 Một số tính chất của dầu tảo sau phản ứng xà phòng hóa 88 Bảng 3.15 Thành phần axít béo trong hỗn hợp dầu sau phản ứng xà phòng hóa lipit 89 Bảng 3.16 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 thu được sau quá trình làm giàu 92
10. viii Bảng 3.17 Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức với urea 93 Bảng 3.18 Thành phần axít béo của TFA thu được từ SKK chủng TB17 96 Bảng 3.19 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa lý của sản phẩm dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 (dạng methyl ester) thu được sau quá trình làm giàu 98 Bảng 3.20 Thành phần axít béo trong pha rắn và pha lỏng sau quá trình tạo phức với urea 99 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của các phương pháp tách chiết dầu khác nhau và các nguồn sinh khối khác nhau đến hiệu suất tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 - 6 100 Bảng 3.22 Thành phần axit béo của hỗn hợp PUFAs thu được ở dạng FFA và methyl ester từ SKK và SKT 102 Bảng 3.23 Thành phần axít béo của hỗn hợp axít béo ω 3 - 6 tách chiết lượng lớn 106 Bảng 3.24 Các chỉ tiêu chất lượng của sản phầm dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 (dạng methyl ester) tách chiết từ sinh khối chủng TB17 107 Bảng 3.25 Tổng hợp thành phần và hàm lượngcác axit béo chủ yếu trong quá trình tách chiết dầu 108 Bảng 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ vitamin E lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3- 6 . 111 Bảng 3.27 Các chỉ tiêu chất lượng của dầu giàu acid béo ω 3 - 6 112 Bảng 3.28 Các chỉ tiêu cảm quan của viên nang mềm AOO-3-6 113 Bảng 3.29 Các chỉ tiêu chất lượng lý hóa, vi sinh vật, kim loại nặng 113 Bảng 3.30 Các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của viên nang mềm thực phẩm chức năng giàu axít béo  3 - 6 114 Bảng 3.31 Các chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại nặng của của viên nang mềm thực phẩm chức năng giàu axít béo  3 - 6 115 Bảng 3.32 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của viên nang dầu tảo AOO-3-6 116 Bảng 3.33 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 đối với trọng lượng cơ thể chuột (n = 10, x ± SD) . 117 Bảng 3.34 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 lên một số chỉ tiêu huyết học của chuột (n = 08, ± SD) 118 Bảng 3.35 Ảnh hưởng của viên nang AOO-3-6 lên nồng độ creatinin huyết thanh chuột (n = 08, ± SD) 120 Bảng 3.36 Tốc độ hình thành phản xạ có điều kiện, tốc độ dập tắt phản xạ có điều kiện tìm thức ăn trong mê lộ của các lô chuột nghiên cứu (n = 8) . 123
11. ix DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA 5 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của EPA 6 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của ω-6 DPA (A) và ω-3 DPA (B) 6 Hình 1.4 Sản xuất axit béo omega - 3 từ các nguồn khác nhau . 12 Hình 1.5 Sơ đồ tách chiết PUFAs từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con người 12 Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và con người . 15 Hình 1.7 Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và docosahexaenoic acid (DHA) ở Thraustochytrids 15 Hình 1.8 Sinh tổng hợp DHA theo con đường hiếu khí ở Thraustochytriidae 16 Hình 1.9 Sinh tổng hợp DHA theo con đường PKS ở Thraustochytriidae 17 Hình 1.10 Vòng đời và sơ đồ tóm tắt các dạng tế bào trong chu kỳ sống của thraustochytrid và labyrinthulid 19 Hình 1.11 Vị trí phân loại của chi Schizochytrium 20 Hình 1.12 Sơ đồ tổng quát của nhân nuôi sinh khối theo mẻ, theo kiểu fed-batch, liên tục và động học tăng trưởng của các quá trình nhân nuôi sinh khối tương ứng . 21 Hình 1.13 Sơ đồ tổng quát hoạt động của các chất chống oxy hóa . 34 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu dầu sinh học giàu ω 3 - 6 từ Schizochytrium mangrovei TB17 58 Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng TB17 62 Hình 3.2 Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của chủng TB17 62 Hình 3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của chủng TB17 64 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng của chủng TB17 64 Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng TB17 . 65 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng của chủng TB17 65 Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường môi trường lên sinh trưởng của chủng TB17 . 66 Hình 3.8 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của chủng TB17 66 Hình 3.9 MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của chủng TB17 trong bình tam giác 1 Lit 67 Hình 3.10 Ảnh hình thái tế bào chủng TB17 nhân nuôi sinh khối trong bình tam giác 1 Lit 68 Hình 3.11 MĐTB và SKK của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit 68 Hình 3.12 Hàm lượng glucose còn dư trong môi trường nuôi và lipit của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit . 68
12. x Hình 3.13 Sinh trưởng của chủng TB17 trong các môi trường nhân nuôi sinh khối khác nhau 74 Hình 3.14 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo mẻ 78 Hình 3.15 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối kiểu fed-batch. 78 Hình 3.16 Ảnh hưởng của các phương pháp thu hoạch sinh khối đến sinh khối tươi (A) và MĐTB tảo trong môi trường sau thu hoạch (B) 80 Hình 3.17 MĐTB tảo trong môi trường nuôi sau thu hoạch bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau 81 Hình 3.18 Ảnh minh họa quá trình thu sinh khối bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau . 81 Hình 3.19 Ảnh hưởng của phương pháp tách chiết lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17 83 Hình 3.20 Ảnh hưởng của các loại dung môi lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17 . 83 Hình 3.21 Ảnh hưởng của phương pháp sấy sinh khối lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17 84 Hình 3.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17 84 Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17 85 Hình 3.24 Ảnh hưởng của chế độ khuấy lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17 85 Hình 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH (A), thời gian phản ứng (B) và nhiệt độ phản ứng (C) lên hiệu suất xà phòng hóa dầu tảo 87 Hình 3.26 Ảnh hưởng của tỉ lệ FFA: urea (A), tỉ lệ Urea: ethanol (B) và nhiệt độ kết tinh (C) lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs của hỗn hợp axit béo tự do 91 Hình 3.27 Ảnh hưởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17 95 Hình 3.28 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ sinh khối lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17 95 Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17 96 Hình 3.30 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17 96 Hình 3.31 Ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urea lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs . 98
13. xi Hình 3.32 Ảnh hưởng của tỷ lệ Urea: methanol lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs 98 Hình 3.33 Thành phần axít béo trong dầu ở dạng FFA và methyl este từ các nguồn SKT và SKK 102 Hình 3.34 Ảnh hưởng của nhiệt độ nước rửa đến hiệu suất thu hồi và pH mẫu dầu thu được 104 Hình 3.35 Ảnh hưởng của số lần rửa nước đến hiệu suất thu hồi và pH mẫu dầu thu được 104 Hình 3.36 Quy trình tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 - 6 PUFAs dạng methyl este từ SKK chủng S. mangrovei TB17 theo phương pháp tạo phức urea 105 Hình 3.37 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHA lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6 109 Hình 3.38 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHT lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6 109 Hình 3.39 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa TBHQ lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6 110 Hình 3.40 Ảnh hưởng của hỗn hợp 3 chất bảo quản theo tỷ lệ 1:1:1 (B) lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6 110 Hình 3.41 Ảnh hưởng của vitamin E nồng độ 0,0075% lên chỉ số peroxyt của dầu sinh học ω 3 - 6 112 Hình 3.42 Ảnh hưởng của viên AOO-3-6 đối với hoạt độ AST (A) và ALT (B), hàm lượng Albumin huyết tương (C) và Chlesterol toàn phần (D) . 120 Hình 3.43 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột lô đối chứng (A), lô TN1 (B) và lô TN2 (C) 121 Hình 3.44 Hình ảnh mô bện học vi thể gan, thận, lách chuột sau 90 ngày uống thuốc lô đối chứng (A, D, H), lô TN1 (B, E, D) và lô TN2 (C, G, K), tương ứng (HE, x400) 121
14. 1 MỞ ĐẦU Hiện nay, khi nhu cầu cuộc sống cũng như những đòi hỏi cao hơn về giá trị dinh dưỡng thì con người không chỉ sử dụng các loại dầu ăn thông dụng mà còn cả các loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho món ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người, dược phẩm. Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa các axít béo không bão hòa có mạch cacbon ≤ 18. Trong đó các loại dầu thực vật như dầu lanh, canola và đậu tương chứa các axit béo không bão hòa đa nối đôi dạng omega-3 (polyunsaturated fatty acid omega 3; PUFAs ω-3) chủ yếu là axít α-linolenic (ALA) và các loại dầu khác như dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho lại chứa chủ yếu là PUFAs ω - 6. Đối với các loại axít béo ω-3 có số cacbon lớn hơn 20 và 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cá biển. Nguồn cung cấp chính các axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) và eicosapentaenoic (EPA; C20:5) là các loài cá nhiều mỡ như cá trích, cá thu và cá hồi. Tuy nhiên, chất lượng của dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào loài cá, mùa vụ và vị trí đánh bắt. Việc sử dụng dầu PUFAs có nguồn gốc từ cá trong khẩu phần thức ăn, kể cả cho trẻ nhỏ cũng như dược phẩm có thể gặp một số bất lợi bởi sự có mặt tạp nhiễm của polychlorinated biphenyls (PCBs) hoặc dioxin, kim loại nặng cũng như mùi vị đặc trưng của cá gây ra. Hơn nữa, dầu cá biển thực tế là một hỗn hợp phức tạp các axít béo có chiều dài mạch cacbon và mức độ chưa bão hoà rất khác nhau. Do vậy, việc tinh sạch chúng rất khó khăn và đòi hỏi chi phí tốn kém trước khi có thể sử dụng chúng vào các mục đích khác nhau cũng như nâng cao giá trị sử dụng các sản phẩm tạo ra so với giá trị ban đầu. Dầu sinh học giàu PUFAs ω 3 - 6 được sản xuất từ một số loài vi tảo đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu và dần có một vị trí đáng kể, không ngừng được mở rộng và phát triển mạnh mẽ trong thị trường thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người, dược phẩm trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Vi tảo biển (VTB) được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai thác các chất có hoạt tính sinh học, để xử lý môi trường, làm phân bón, nhiên liệu sinh học và được ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) với một số loài VTB quang tự dưỡng truyền thống. Tuy nhiên, việc nuôi trồng VTB quang tự dưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất các sản phẩm đi từ sinh khối tảo có giá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa trên quy mô lớn. Để khắc phục những nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác và ứng dụng các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) trong đó có chi Schizochytrium đang thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cả trong và ngoài nước nhưng vẫn còn rất mới mẻ ở Việt Nam và hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con người.
15. 2 Các loài VTBDD thuộc chi Schizochytrium có khả năng tích lũy hàm lượng lipit cao, có thể lên tới 70% sinh khối khô (SKK) và hàm lượng -3 PUFAs như EPA, DHA chiếm 30-50% so với axít béo tổng số (Total fatty acid - TFA). Vai trò của -3 PUFAs nêu trên đã được chứng minh ở nhiều khía cạnh như sự phát triển trí não của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ thần kinh và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm cảm. Hiện nay, chi VTBDD Schizochytrium được coi là một trong các ứng cử viên tiềm năng thay thế nguồn sản xuất -3 PUFAs truyền thống từ dầu cá. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về nhân nuôi sinh khối, tách chiết và ứng dụng của các axít béo trên từ VTBDD còn rất mới mẻ và có nhiều tiềm năng ứng dụng. Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 - 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người”. Mục tiêu nghiên cứu của luận án 1. Sàng lọc chủng/loài VTBDD và tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu được sinh khối giàu axít béo ω 3 - 6; 2. Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω 3 - 6 từ loài vi tảo biển dị dưỡng lựa chọn được; 3. Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 có tính an toàn cao và đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập của viên nang trên động vật thực nghiệm. Một số nội dung nghiên cứu chính của luận án 1. Sàng lọc chủng tiềm năng giàu axít béo ω 3 - 6 từ các loài VTBDD Việt Nam; tối ưu các điều kiện nhân nuôi thu sinh khối chủng tiềm năng ở quy mô bình tam giác, ở các hệ thống khác nhau (5, 10, 30 và 150 Lít); 2. Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh sạch và bảo quản dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người; 3. Sản xuất viên nang Algae oil omega 3 - 6 (AOO-3-6) từ dầu sinh học giàu axít béo ω 3 - 6 đảm bảo chất lượng, có tính an toàn cao và đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập của viên AOO-3-6 trên mô hình động vật thực nghiệm. Những đóng góp mới của luận án - Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có hệ thống về: sàng lọc, nhân nuôi sinh khối chủng vi tảo biển dị dưỡng tiềm năng Schizochytrium mangrovei TB17 được phân lập ở tỉnh Thái Bình, Việt Nam có hàm lượng PUFAs ω 3 - 6 cao, trong đó DHA chiếm 42,68 ±1,76% so với TFA và axit docosapentaenoic (DPA) chiếm 11,02 ± 1,14% so với TFA; lựa chọn được các điều
16. 3 kiện thích hợp cho tách chiết, tinh sạch axít béo ω 3 - 6 từ chủng TB17 có hàm lượng axit béo ω 3 - 6 cao (đặc biệt là DHA, EPA và DPA đạt 86,33 ± 2,34% so với TFA); bao viên nang AOO-3-6 và đã đánh giá được tính an toàn, tác dụng dược lý của viên nang ở mô hình động vật thực nghiệm; viên nang đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người. - Lần đầu tiên ở Việt Nam đã chứng minh được viên nang AOO-3-6 có chứa dầu ω 3 - 6 tách chiết từ S. mangrovei TB17 an toàn và có khả năng cải thiện trí nhớ, khả năng học tập trên mô hình động vật thực nghiệm. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án - Có được các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của chủng S. mangrovei TB17 phân lập ở Diêm Điền, Thái Bình năm 2010 (nhân nuôi sinh khối theo mẻ ở hệ thống lên men 30 Lít, môi trường M12 - sử dụng cao nấm men công nghiệp) đạt sinh trưởng với mật độ tế bào (128,42 0,27 x106 tế bào/mL), SKK (30,83 0,25 g/L) và lipit (65,96 0,31% SKK). Tổng hàm lượng các axit béo ω 3 - 6 (47,35 ± 1,39% so với TFA), sản lượng DHA (40,17 ± 1,75 mg/L/giờ); - Có được quy trình tách chiết dầu sinh học giàu các axít béo ω 3 - 6 từ S. mangrovei TB17 có độ tinh sạch cao (99,46 ± 2,66% so với TFA) đạt tiêu chuẩn chất lượng để làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người; - Có được bộ số liệu về tính an toàn và tác dụng dược lý của viên AOO-3-6 trên động vật thực nghiệm, cung cấp cơ sở khoa học cho việc định hướng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người. Bố cục của luận án Luận án gồm 148 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 34 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, kết quả và thảo luận 65 trang, kết luận và kiến nghị 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 22 trang gồm 241 tài liệu. Trong luận án có 58 hình, 41 bảng và 48 trang phụ lục.
17. 4 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về axit béo, vai trò, nguồn gốc và con đường sinh tổng hợp axít béo Các axít béo ω 3 - 6 có nhiều chức năng sinh học như: cải thiện hiệu quả bệnh tim mạch; giảm nguy cơ loạn nhịp tim (có thể dẫn tới đột tử); có hiệu quả rõ rệt trong điều trị suy nhược; giảm nguy cơ hình thành khối u tuyến tiền liệt (có thể dẫn đến đau tim và đột quỵ); làm chậm tốc độ tăng trưởng của mảng xơ vữa động mạch; cải thiện chức năng nội mô; hạ huyết áp (nhẹ) và giảm phản ứng viêm. Chính những đặc điểm trên mà các axít béo ω 3 - 6 ngày càng được ứng dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người. Do vậy, những đặc điểm chính về axít béo ω 3 - 6 sẽ được trình bày khái quát dưới đây. 1.1.1. Giới thiệu chung về axit béo Axít béo có công thức tổng quát: CH3-(CH2)n-COOH. PUFAs là các axít béo mạch dài (18 - 22 nguyên tử cacbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết đôi. Mạch hydrocarbon có 2 đầu: một đầu là nhóm methyl và một đầu là nhóm cacboxyl. Chúng được phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên tính từ gốc methyl hay gốc cacboxyl. Để chỉ vị trí nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon được tính từ đầu methyl người ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hoặc “ω”. Các liên kết đôi trong PUFAs cũng có thể được tính từ gốc carboxyl và được ký hiệu “Δ”. Những nhóm ω-3, ω-6 hay ω-9 PUFAs có liên kết đôi đầu tiên tương ứng tại vị trí cacbon số 3, 6 hay 9 tính từ gốc methyl [1]. Mạch cacbon của axít béo no thường có dạng zíc zắc, kéo thành chuỗi dài không cong. Các axít béo không no, có một liên kết đôi dạng cis thì mạch cacbon bị uốn cong 30°, càng có nhiều liên kết đôi, mạch cacbon càng bị uốn cong nhiều hơn. Có giả thiết cho rằng mạch cacbon của axít béo không no dạng cis có ý nghĩa quan trọng đối với màng sinh học. Theo nghiên cứu của Kelter và cộng sự (1999) [2] cho thấy các phân tử không thể chuyển từ dạng cis- sang dạng trans- hoặc ngược lại trong trường hợp bình thường. Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là nguyên nhân dẫn đến tính chất khác nhau của các axít béo. Vị trí của các nối đôi trong chuỗi cacbon của PUFAs tạo nên một sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Các tế bào của cơ thể con người chỉ có thể tạo nối đôi C = C tổng hợp axít béo kể từ cacbon thứ 9 trở đi. Điều này có nghĩa là con người không thể tự tổng hợp được axít béo ω - 3 và ω - 6. Do đó hai loại axít béo này chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn uống hàng ngày [3]. Hoạt
18. 5 tính sinh học của các axít béo phụ thuộc vào các dạng cấu trúc hóa học đặc trưng của chúng. Axít béo có một số dạng cấu trúc chính như ethyl este (EE), axít béo tự do (free fatty acid - FFA) và triacylglycerols (TAGs). Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các axít béo dạng EE có hoạt tính sinh học thấp hơn so với dạng FFA và TAG [4]. Sự hấp thụ EPA ở dạng triglycerid là 90% trong khi ở dạng ethyl ester chỉ là 60% [5]. Có hai nhóm axít béo không thay thế quan trọng là ω - 3 và ω - 6. Các axít béo ω - 3 quan trọng nhất là: ALA (C18:3), EPA, DHA, DPA. Các axít béo ω - 6 chính là: axit linoleic (LA; C18:2 ω-6), gama linoleic (GLA - C18:3), eicosadienoic, dihomo-gamma-linoleic (DGLA), ARA (C20:4), DPA [6]. 1.1.1.1. Axít docosahexaenoic (DHA) DHA có công thức phân tử C22H32O2, là một axít béo ω - 3 không bão hòa đa nối đôi. Nó có 22 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 6 liên kết đôi ở các vị trí cacbon số 4, 7, 10, 13, 16 và 19, có công thức tổng quát là: CH3(CH2CH = CH)6(CH2)2COOH và được kí hiệu là C22:6 ω-3 [7]. DHA có thể được chuyển thành docosanoids. Các liên kết đôi (- C = C -) có cấu hình cis (- C/C = C\C -) để hoạt động sinh lý. Cấu trúc không bão hòa đa nối đôi (= CH - CH2 - CH =) xoay quanh là các liên kết đơn (C - C) liền kề. Do đó, nó làm tăng khả năng liên kết hơn so với phân tử không có liên kết đôi nào. Điều này làm tăng tính linh hoạt của phân tử rất nhiều [8]. Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 g/mol. Ở điều kiện chuẩn, DHA tồn tại dạng lỏng, không tan trong nước, tan trong dung môi không phân cực. Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của DHA được trình bày trên Hình 1.1 [7]. A B Hình 1.1. Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA [7] 1.1.1.2. Axít eicosapentaenoic (EPA) EPA có công thức phân tử C20H30O2, là một axít béo ω-3 không bão hòa đa nối đôi. Nó có 20 nguyên tử cacbon trong chuỗi hydrocarbon, có 5 liên kết đôi ở các vị trí cacbon số 5, 8, 11, 14 và 17, có công thức tổng quát là: CH3(CH=CH=CH)5 (CH2)3COOH và ký hiệu là C20:5 ω-3. Trọng lượng phân tử của EPA là 302,451 g/mol. EPA tồn tại dạng lỏng ở điều kiện chuẩn, bay hơi ở 439oC, khối lượng riêng