Luận án Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 12/2021
2. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGÔ MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS Chu Hoàng Hà 2. GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 12/2021
3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Chu Hoàng Hà và GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí và hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các kết quả đã trình bày trong luận án. Thái Nguyên, tháng 12 năm 2021 TÁC GIẢ Ngô Mạnh Dũng
4. ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Chu Hoàng Hà và GS.TS. Chu Hoàng Mậu, người đã trực tiếp hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, động viên tôi có được sự tự tin, khắc phục khó khăn để hoàn thành tốt bản luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc, TS. Đỗ Tiến Phát, ThS Tạ Thị Đông, ThS Nguyễn Hồng Nhung và các cán bộ, nghiên cứu viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng, phòng Công nghệ tế bào thực vật và phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành các thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ trong bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp tôi tích lũy nhiều kiến thức, phương pháp nghiên cứu về các vấn đề hiện đại của sinh học và công nghệ sinh học, đồng thời đưa ra nhiều đóng góp quý báu để tôi có thể hoàn thành kế hoạch học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo, Bộ phân đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này. Tôi xin bày tỏ lòng tri ân và biết ơn sâu sắc tới thầy cô, gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ khó khăn trong suốt chặng đường học tập, nghiên cứu của tôi thời gian qua. Thái Nguyên, tháng 12 năm 2021 TÁC GIẢ Ngô Mạnh Dũng
5. iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục hình ix Danh mục bảng xi MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN VÀ CƠ CHẾ CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 6 1.1.1. Ảnh hưởng của stress hạn đến sự sinh trưởng, phát triển và đặc tính sinh lý, sinh hoá của thực vật 6 1.1.2. Phản ứng của thực vật trong điều kiện stress hạn 11 1.2. GLYCINE BETAINE, CHOLINE OXIDASE 18 1.2.1. Glycine betaine 18 1.2.2. Choline oxidase 23 1.3. NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở ĐẬU TƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN 29 1.3.1. Cây đậu tương 29 1.3.2. Chuyển gen ở đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 31 1.3.3. Nâng cao khả năng chịu hạn ở đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen 33 1.3.4. Tình hình nghiên cứu chuyển gen codA ở thực vật 38 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 46 2.1.1. Vật liệu thực vật 46 2.1.2. Các chủng vi khuẩn và các loại vector 46 2.1.3. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 46 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ 48 2.2.1. Hoá chất 48
6. iv 2.2.2. Thiết bị 48 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 2.3.1. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA và chuyển gen ở thuốc lá 49 2.3.2. Nhóm phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cho chuyển gen ở giống đậu tương ĐT22 53 2.3.3. Nhóm phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen codA 55 2.3.4. Phân tích và xử lý dữ liệu 60 2.4. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 61 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 62 3.1. THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CODA 62 3.1.1. Tạo cấu trúc chuyển gen codA 62 3.1.2. Đánh giá hoạt động của vector mang gen chuyển codA trên cây thuốc lá 66 3.1.3. Thảo luận kết quả thiết kế vector và hoạt động của vector biểu hiện trên cây thuốc lá 69 3.2. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HIỆU QUẢ CHUYỂN GEN CODA Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 72 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến khả năng tạo chồi đậu tương 73 3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn và thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi đậu tương 74 3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi đậu tương 78 3.2.4. Thảo luận kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu quả chuyển gen codA ở giống đậu tương ĐT22 79 3.3. BIẾN NẠP GEN CODA VÀO GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN CHỊU HẠN 82 3.3.1. Kết quả chuyển gen codA vào giống đậu tương ĐT22 82 3.3.2. Phân tích cây đậu tương chuyển gen 84 3.3.3. Thử nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen 90
7. v 3.3.4. Thảo luận kết quả biến nạp gen codA vào giống đậu tương ĐT22 và thử nghiệm khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103
8. vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid APX Ascorbate peroxidase BADH Betaine aldehyde dehydrogenase BAP 6-benzyladenine purin bar Bialaphos resistance bp Base pair Cặp base CAM Crassulacean acid metabolism CAT Catalase CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy CHDH Choline dehydrogenase CMO Choline monooxygenase COD Choline oxidase codA Choline oxidase from Agrobacterium globiformis CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide DHAR Dehydroascorbate reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DW Dry weight Khối lượng khô ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAD Flavin adenine dinucleotide FW Fresh weight Khối lượng tươi GA3 Gibberellic acid GB Glycine Betaine GM Germination medium Môi trường nảy mầm HSP Heat shock protein
9. vii IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3-butyric acid kb Kilo base kDa Kilo Dalton Môi trường dinh dưỡng cơ LB Luria Bertani bản nuôi cấy vi khuẩn LEA Late embryogenesis abundant MAPK Microtubule associated protein kinase MDA Malondialdehyde MDHAR Monodehydroascorbate reductase MES 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Môi trường dinh dưỡng MS Murashige and Skoog cơ bản MS mRNA Messenger ribonucleic acid NAA α-Naphthaleneacetic acid OD Optical density Mật độ quang pat Phosphinothricin acetyltransferase PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase PEAMT phosphoethanolamine N-methyltransferase PEG Polyethylene glycol PEPC Phosphoenolpyruvate carboxylase PHBH p-hydroxybenzoate hydroxylase POD Peroxidase PPT Phosphinothricin rd29A Response-to-Dehydration 29A RM Rooting medium Môi trường ra rễ ROS Reactive oxygen species SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi
10. viii SIM Shoot induction medium Môi trường tạo chồi SOD Superoxide dismutase Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase Vùng DNA plasmid T-DNA Transfer DNA chuyển vào thực vật Ti- plasmid Tumor inducing - plasmid T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen KLK Khối lượng khô UV Ultraviolet Tia cực tím WT Wild type Cây không biến nạp 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- X-gal galacto-pyranoside YEP Yeast extract peptone Cao chiết nấm men
11. ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc không gian (a) và cấu trúc phân tử (b) của GB 19 Hình 1.2. Các con đường sinh tổng hợp GB 20 Hình 1.3. Quá trình oxy hóa choline thành GB xúc tác bởi choline oxidase 24 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của choline oxidase độ phân giải 1,86 Å 24 Hình 1.5. Vị trí hoạt động của choline oxidase kiểu dại với sản phẩm hoạt động 25 liên kết với GB [150] 25 Hình 1.6. Lối vào vị trí hoạt động của choline oxidase [137] 26 Hình 2.1. Trình tự gen codA được tổng hợp bởi Epoch Life Science Inc. 47 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 49 Hình 2.3. Sơ đồ các vector pIBTII-rd29A-codA, pIBTII-HSP-codA, pIBTII-35S- codA 51 Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pIBTII và pCAMBIA bằng enzyme HindIII và EcoRI 62 Hình 3.2. Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn E. coli chứa các vector thiết kế 64 Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid pIBTII mang các cấu trúc gen thiết kế 64 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn A. tumefaciens C58 mang các cấu trúc gen thiết kế 65 Hình 3.5. Hình ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng thuốc lá chuyển gen .67 Hình 3.6. Chồi thuốc lá chuyển gen chọn lọc trên môi trường bổ sung PPT 1,5 mg/l .67 Hình 3.7. Kết quả gây hạn sinh lý bằng PEG 8000 2,5% các dòng thuốc lá chuyển gen 68 Hình 3.8. Kết quả định lượng hàm lượng GB trong các dòng thuốc lá chuyển gen 69 Hình 3.9. Các mảnh lá mầm trên môi trường chọn lọc SIM2 với nồng độ PPT khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy 74
12. x Hình 3.10. Các mảnh lá mầm sau các thời gian đồng nuôi cấy khác nhau 77 Hình 3.11. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tạo cây đậu tương chuyển gen 83 Hình 3.12. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T0 bằng PPT 84 Hình 3.13. Kết quả kiểm tra các dòng đậu tương T1 bằng PPT 84 Hình 3.14. Kết quả kiểm tra cây T0 bằng PCR 86 Hình 3.15. Kết quả kiểm tra cây T1 bằng PCR 86 Hình 3.16. Kết quả phân tích Southern blot các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 88 Hình 3.17. Kết quả phân tích Western blot các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 89 Hình 3.18. Khả năng nảy mầm của đậu tương sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường hạn nhân tạo 90 Hình 3.19. Chiều dài thân mầm của các dòng hạt đậu tương trên môi trường hạn nhân tạo 91 Hình 3.20. Kiểu hình của các dòng đậu tương vào ngày thí nghiệm thứ 9 trong điều kiện hạn nhân tạo 93 Hình 3.21. Sinh khối thu được vào ngày thứ 9 của các dòng đậu tương trong thí nghiệm chịu hạn nhân tạo 94 Hình 3.22. Hàm lượng GB của các dòng đậu tương chịu hạn 95 Hình 3.23. Hàm lượng proline của các dòng đậu tương chịu hạn 95 Hình 3.24. Hàm lượng MDA của các dòng đậu tương chịu hạn 96 Hình 3.25. Hoạt độ POD của các dòng đậu tương chịu hạn 97
13. xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số loài cây trồng chuyển gen codA mã hóa choline oxidase sinh tổng hợp GB tăng khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học 44 Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu 47 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng nối với T4 ligase 52 Bảng 2.3. Môi trường nuôi khuẩn 54 Bảng 2.4. Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen codA ở đậu tương 56 Bảng 3.1. Kết quả biến nạp gen codA vào giống thuốc lá K326 sử dụng PPT sàng lọc 66 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ PPT đến khả năng tạo chồi 74 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ khuẩn đến khả năng cảm ứng tạo chồi 75 Bảng 3.4. Ảnh hưởng cuả thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi 77 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến khả năng diệt khuẩn và tạo chồi của các mảnh lá mầm sau chuyển gen 78 Bảng 3.6. Kết quả biến nạp vector chuyển gen vào mảnh lá mầm đậu tương 82 Bảng 3.7. Kết quả biến nạp các cấu trúc chuyển gen codA 85 Bảng 3.8. Các dòng đậu tương thế hệ T1 có biểu hiện gen codA và có khả năng chống chịu hạn 87
14. ` 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Biến đổi khí hậu đang diễn ra trên quy mô toàn cầu dẫn tới tình trạng hạn hán, đặc biệt là hạn mặn ngày càng kéo dài, gây khó khăn lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp. Bên cạnh đó, biến đổi khí hậu cũng khiến diện tích đất sản suất nông nghiệp bị thu hẹp, gia tăng sự suy thoái đất, xói mòn rửa trôi, thường xuyên khan hiếm về nguồn nước. Stress hạn đã trở thành một trở ngại lớn đối với nền sản xuất nông nghiệp, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng nông nghiệp toàn cầu. Cường độ và mức độ nghiêm trọng của hạn hán được dự đoán sẽ còn gia tăng trong thời gian tới [109]. Vì vậy, việc chọn tạo giống các cây trồng có khả năng chịu hạn nhằm ứng phó với những tác động của biến đổi khí hậu là vấn đề mang tính cấp thiết và thời sự. Đậu tương là một trong những cây nông nghiệp quan trọng trên thế giới, là nguồn cung cấp protein bổ dưỡng với chi phí thấp, được sử dụng làm thức ăn cho con người và gia súc với các sản phẩm đa dạng từ sử dụng trực tiếp hạt thô đến chế biến thành phẩm Ngoài ra, đậu tương còn giữ vai trò cải tạo đất nông nghiệp do khả năng cố định nitơ trong khí quyển. Tại Việt Nam, cây đậu tương giữ vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng, tuy nhiên, năng suất đậu tương ở Việt Nam còn thấp, diện tích trồng trọt chưa được mở rộng nhiều. Nguyên nhân chính là chưa có giống đậu tương phù hợp, quy mô sản xuất nhỏ lẻ và điều kiện thời tiết không thuận lợi. Cây đậu tương tuy có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém. Đậu tương dễ bị tổn thương bởi các stress phi sinh học và hạn là một nguyên nhân chính làm giảm năng suất, sản lượng đậu tương. Những ảnh hưởng nổi bật nhất của hạn là giảm khả năng nảy mầm, cây sinh trưởng phát triển kém, còi cọc, giảm quang hợp, giảm khả năng hút khoáng. Trong bối cảnh hiện nay, vấn đề nâng cao khả năng chịu hạn ở cây đậu tương để giảm thiểu thiệt hại
15. ` 2 năng suất trong điều kiện môi trường thiếu nước là nhiệm vụ cấp bách của các nhà chọn giống cây trồng nông nghiệp. Trên thế giới, việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương đã được quan tâm nghiên cứu với nhiều hướng tiếp cận khác nhau, như sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại. Trong đó, những hiểu biết và tiến bộ của các kỹ thuật chuyển gen hiện nay đã mở ra triển vọng lớn trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây đậu tương. Đối với thực vật, đặc tính chịu hạn là tính trạng số lượng phức tạp, chịu ảnh hưởng của một hệ thống các gen mục tiêu cũng như sự chi phối của các yếu tố môi trường, vật lý và hoá học. Sản phẩm của các gen này tác động trực tiếp đến sự biểu hiện của đặc tính chịu hạn hoặc điều hòa chức năng nhóm gen chịu hạn, như kiểm soát sự đóng mở khí khổng, giảm nồng độ ROS (reactive oxygen species), tăng cường phát triển bộ rễ, điều chỉnh thẩm thấu, bảo vệ tính toàn vẹn của màng, ổn định cấu trúc enzyme hoặc protein [68]. Khi gặp điều kiện khô hạn, thực vật thường có xu hướng tăng cường tổng hợp, tích luỹ các chất chuyển hoá như các loại đường tan, amino acid để điều chỉnh áp suất thẩm thấu cho tế bào. Vì vậy, một trong các hướng nghiên cứu tiếp cận cơ chế chống chịu hạn hiện nay chính là làm gia tăng các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng về nước. Trong đó, glycine betaine (GB) là một trong những chất bảo vệ thẩm thấu được nghiên cứu rộng rãi nhất. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, GB là chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào khi thực vật sống trong các điều kiện bất lợi. Nhiều loại gen đã được sử dụng để tạo ra cây chuyển gen có sự tăng tích lũy GB đã cho thấy sự hiệu quả trong việc tăng cường khả năng chịu đựng các stress phi sinh học và tăng năng suất. Một số cây trồng chuyển gen mã hoá enzyme liên quan đến sinh tổng hợp GB cũng thể hiện khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường như chịu nóng [175]; chịu lạnh [134]; chịu hạn [171] và chịu mặn [160].
16. ` 3 Trong số các con đường sinh tổng hợp GB ở các đối tượng sinh vật khác nhau, con đường sinh tổng hợp GB từ tiền chất choline xúc tác bởi enzyme choline oxidase (COD) được mã hóa bởi gen codA là có hiệu quả và đơn giản nhất. Gen codA đã trở thành mục tiêu nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học đối với kỹ thuật trao đổi chất của các loài thực vật quan trọng về mặt kinh tế để chống chịu stress thẩm thấu [133]. Phương pháp chuyển gen codA từ Arthrobacter globiformis vào các loại cây trồng không tích lũy GB tự nhiên như đậu xanh [21]; khoai tây [38]; cà chua [164] để nâng cao khả năng chống chịu trong các điều kiện stress phi sinh học khác nhau đã chứng minh sự đơn giản và hiệu quả của phương pháp này. Tại Việt Nam, gen codA mã hoá sinh tổng hợp GB đã được chuyển thành công vào cây xoan [5], [9] và cây thuốc lá [78]; các cây chuyển gen này có khả năng chịu hạn, chịu mặn hơn so với các cây đối chứng không chuyển gen. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen codA liên quan đến sinh tổng hợp GB nhằm nâng cao khả năng chịu hạn ở đậu tương giúp cây phát triển tốt hơn, cho năng suất và sản lượng cao hơn trong điều kiện môi trường bất lợi là nghiên cứu mang tính thực tiễn và cần thiết. Xuất phát từ cơ sở khoa học và nhu cầu thực tiễn về tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn bằng công nghệ chuyển gen, chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp được cấu trúc mang gen chuyển codA vào đậu tương và tạo được cây đậu tương chuyển gen codA mã hóa choline oxydase có khả năng chịu hạn cao hơn cây không chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu tạo cấu trúc chuyển gen mang gen codA trong vector biểu hiện thực vật
17. ` 4 1) Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật chứa cấu trúc mang gen codA. 2) Biến nạp cấu trúc chuyển gen mang gen codA vào mô cây thuốc lá. Đánh giá hoạt động và biểu hiện gen chuyển codA trên các dòng thuốc lá chuyển gen. 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nhằm thăm dò hiệu quả chuyển gen codA ở cây đậu tương 1) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ phosphinothricin (PPT) đến khả năng tạo chồi từ lá mầm đậu tương. 2) Phân tích ảnh hưởng của nồng độ khuẩn và thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả năng cảm ứng tạo chồi đậu tương. 3) Phân tích ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh và thời gian diệt khuẩn đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi đậu tương. 3.3. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen codA vào giống đậu tương ĐT22 và tạo cây đậu tương chuyển gen chịu hạn 1) Biến nạp di truyền và tạo cây đậu tương chuyển gen codA. 2) Phân tích cây đậu tương chuyển gen codA. 3) Đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng đậu tương chuyển gen codA. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam tạo thành công cây đậu tương mang gen codA tăng khả năng chịu hạn so với cây đậu tương không biến nạp. Luận án là công trình có hệ thống với nội dung được trình bày từ thiết kế vector chuyển gen thực vật, phân tích biểu hiện gen và tạo dòng cây chuyển gen codA có hàm lượng GB tích luỹ cao. Cụ thể là: 1) Đã xác định được các yếu tố thích hợp cho chuyển gen codA và tạo đa chồi ở giống đậu tương ĐT22. Nồng độ PPT 3 mg/l ở giai đoạn cảm ứng tạo chồi trong môi trường SIM và nồng độ PPT 1,5 mg/l ở giai đoạn kéo dài chồi trong môi trường SEM; dịch khuẩn có giá trị OD650= 0,6, thời gian ủ khuẩn 30 phút, đồng
18. ` 5 nuôi cấy 5 ngày trong tối và diệt khuẩn bằng cefotaxime 500 mg/l là thích hợp cho cảm ứng tạo chồi và kéo dài chồi trên môi trường chọn lọc. 2) Lần đầu tiên gen codA được chuyển thành công và biểu hiện ở cây đậu tương Việt Nam. Sự biểu hiện của gen chuyển codA trong cây đậu tương chuyển gen đã làm tăng hàm lượng GB, proline, tăng hoạt độ của POD, giảm hàm lượng MDA so với cây cây đậu tương không chuyển gen. 3) Bốn dòng đậu tương chuyển gen codA ở thế hệ T1 đã được đánh giá, hàm lượng GB ở dòng đậu tương chuyển gen tăng từ 248,9% - 288,3% so với cây không chuyển gen; hàm lượng proline tăng 1,5 - 2 lần, hoạt động của POD tăng lên gấp 4 lần và hàm lượng MDA giảm 0,5 lần so với cây không chuyển gen. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Kết quả nghiên cứu đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu các stress phi sinh học của cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen. Về mặt khoa học, kết quả của luận án đã chứng minh được sự tăng cường biểu hiện gen codA mã hóa enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp GB đã làm tăng khả năng chống chịu hạn ở cây đậu tương. Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để cải thiện khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh ở thực vật nói chung và cây họ đậu nói riêng bằng kỹ thuật biểu hiện gen. Kết quả đăng tải trên các bài báo khoa học là tài liệu tham khảo có giá trị phục vụ nghiên cứu và giảng dạy sinh học. Về mặt thực tiễn, các dòng đậu tương chuyển gen codA có thể được sử dụng làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, đáp ứng một phần nhu cầu đậu tương đang thiếu trong nước hiện nay. Kết quả nghiên cứu của luận án có thể áp dụng vào các giống cây họ đậu và các loài thực vật khác trong định hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng GB giúp tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường.
19. ` 6 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÁC ĐỘNG CỦA HẠN VÀ CƠ CHẾ CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 1.1.1. Ảnh hưởng của stress hạn đến sự sinh trưởng, phát triển và đặc tính sinh lý, sinh hoá của thực vật 1.1.1.1. Tác động của hạn đến sự sinh trưởng và phát triển Stress hạn được hiểu và định nghĩa dưới nhiều góc độ khác nhau. Trong nông nghiệp, stress hạn là hiện tượng xảy ra khi môi trường không đủ nước cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây trồng tại một thời điểm nhất định. Mức độ nghiêm trọng của stress hạn phụ thuộc vào thời gian và cường độ hạn, lượng mưa, khả năng giữ nước của đất, sự thoát hơi nước của lá và sức sống của thực vật [136]. Thực vật chịu áp lực của stress hạn khi độ ẩm trong đất thấp, lượng nước có sẵn cho rễ giảm hoặc/và khi tốc độ thoát hơi nước của lá cao hơn so với mức độ hấp thu nước của rễ. Các triệu chứng hạn ở thực vật khác nhau giữa các loài thực vật, tùy thuộc vào khả năng chống chịu, điều kiện sinh trưởng, giai đoạn phát triển và các yếu tố của môi trường. Các triệu chứng này bao gồm cả những thay đổi về mặt hình thái như héo rũ, rụng lá, già hoá sớm cũng như sự thay đổi ở cấp độ tế bào: giảm sức trương, đóng khí khổng, mất cân bằng áp suất thẩm thấu và tăng sản xuất ROS. Một số thực vật có khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn. Khả năng chịu hạn là một đặc điểm phức tạp xảy ra thông qua một số cơ chế: (i) trốn hạn (tăng tốc giai đoạn sinh sản của cây trước khi bị stress có thể cản trở sự tồn tại của nó), (ii) tránh hạn (chịu đựng với lượng nước bên trong tăng lên và ngăn ngừa tổn thương mô) và (iii) chịu hạn (khả năng chịu đựng với hàm lượng nước bên trong thấp trong khi vẫn duy trì sự phát triển trong thời gian khô hạn) [24]. Sau một thời gian khô hạn, tỷ lệ cây sống sót khi được tưới lại được gọi là tỷ lệ sống sót trong hạn hán. Stress hạn là một yếu tố ảnh hưởng đến hình thái, sinh lý và sự phát triển của
20. ` 7 cây từ giai đoạn hạt nảy mầm, phát triển chồi và rễ, thân và lá cho đến giai đoạn sinh sản [109]. Giai đoạn hạt nảy mầm là giai đoạn rất nhạy cảm với stress hạn. Trong điều kiện hạn hán, quá trình nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây non có nhiều thay đổi đáng chú ý, như giảm số lượng và tỷ lệ nảy mầm của hạt; giảm chiều dài, khối lượng chất khô của rễ và chồi; giảm khả năng sống sót của cây con, kéo dài thời gian nảy mầm của hạt [128]. Độ ẩm đóng vai trò thiết yếu trong việc kích hoạt enzyme trong quá trình nảy mầm. Tỷ lệ nảy mầm bị giảm đáng kể ở cây đậu gà (Cicer arietinum L.) trong điều kiện thiếu nước [20]. Trong giai đoạn sinh trưởng của cây, ảnh hưởng sớm nhất khi gặp stress hạn là héo lá, giảm chiều cao cây, gián đoạn quá trình hình thành chồi và hoa. Chiều cao thực vật có liên quan chặt chẽ đến kích thước tế bào và sự già hoá của lá. Chiều cao cây giảm chủ yếu là do giảm khả năng hút, vận chuyển khoáng trong cây, giảm khả năng phân chia và kích thước tế bào, tăng rụng lá trong điều kiện khô hạn [169]. Nước có ảnh hưởng nhất định đến sự phân bố của rễ cây. Khi thiếu nước, thực vật có xu hướng tăng cường hút nước từ các tầng đất sâu hơn bằng cách phát triển cấu trúc bộ rễ thông qua sự tăng trưởng của chiều dài rễ cái và sự tăng số lượng, lan rộng của các rễ bên [135]. Ở đậu tương, sự ức chế sinh trưởng ở chồi mạnh hơn, sinh khối của chồi giảm nhiều hơn so với rễ, dẫn đến tỷ lệ rễ/ chồi cao hơn trong điều kiện thiếu nước [49]. Để chống lại hạn hán, đậu tương có xu hướng phát triển hệ thống rễ bên lớn hơn, số lượng lông rễ nhiều hơn và đường kính xylem to hơn. Sự thiếu hụt đạm sẽ có thể xảy ra khi stress hạn làm giảm số lượng và khối lượng khô của nốt sần cây đậu tương. Khi đậu tương bị thiếu đạm, rễ ít phân nhánh, cây thấp còi, ít quả và hạt hơn cây khỏe mạnh, ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất [92]. Lá là bộ phận chính của cây, diện tích bề mặt lá có ảnh hưởng lớn đến quá trình quang hợp và sự phát triển của cây. Trong điều kiện khô hạn, hiện tượng giảm kích thước và số lượng lá, lá già hoá sớm đã được quan sát thấy ở nhiều loài thực vật [26]. Sự biến đổi hình thái, kích thước lá có vai trò quan trọng trong khả năng
21. ` 8 chịu hạn của cây trồng. Đây là một cơ chế tránh hạn của cây vì giảm diện tích lá tác động tới sự thoát hơi nước khí khổng, giúp cân bằng lượng nước hấp thụ từ rễ và vận chuyển nước ở các bộ phận khác nhau của cây [22]. Tuy nhiên, stress hạn kéo dài dẫn tới khả năng quang hợp giảm, cây có ít năng lượng hơn để sinh trưởng và phát triển. Một hiện tượng hình thái lá khác dễ quan sát là hiện tượng cuốn lá do mất áp suất nước từ lớp biểu bì mặt trên của lá khi cây thiếu nước. Ở lúa mì, cây sẽ bị cuốn lá nặng nếu chịu tác động của hạn [166]. Giai đoạn phát triển của cây cũng rất dễ bị ảnh hưởng bởi sự khan hiếm nước. Stress hạn ảnh hưởng nghiêm trọng đến thời gian ra hoa, sự phát triển của hoa, quá trình thụ phấn, kết hạt và tạo quả [124]. Số hạt trên mỗi cây giảm nhiều nhất khi hạn xảy ra ở giai đoạn ra hoa. Khi đó, thời gian ra hoa bị rút ngắn, hoa tạo ra ít hơn, quả ít hơn và do đó, số lượng hạt trên mỗi cây ít hơn [147]. Trung bình một cây đậu tương cho 25- 40 quả, mỗi quả chứa trung bình 2,5 hạt. Khi khô hạn xảy ra ở giai đoạn làm đầy quả, số lượng quả có thể giảm tới 20% [98]. Những tác động của hạn có thể ảnh hưởng tiêu cực tới năng suất và có thể làm giảm 73–82% năng suất hạt trên mỗi cây đậu tương [165]. 1.1.1.2. Tác động của hạn đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá i) Tác động của hạn đến quang hợp Quang hợp là một trong những quá trình quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển ở thực vật. Tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọng và thời gian stress hạn mà quang hợp chịu tác động ở các mức độ khác nhau. Stress hạn làm giảm nồng độ CO2 khuếch tán đến lục lạp, hạn chế sự trao đổi chất trong tế bào. Độ ẩm trong đất thấp làm tăng nồng độ muối, giảm thế năng của nước so với tế bào thực vật. Điều này dẫn đến giảm sức trương và ức chế sự phát triển của tế bào. Kết quả của sự mất nước ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và do đó làm rối loạn chức năng của bộ máy quang hợp [174]. Điều kiện stress hạn cấp tính cũng gây rối loạn hoạt động của enzyme Rubisco cùng các enzyme khác liên quan đến quá trình quang hợp và là nguyên nhân làm mất sắc tố quang
22. ` 9 hợp [30]. Hiệu suất quang hợp, độ mở khí khổng, tốc độ thoát hơi nước giảm đáng kể trong thời gian hạn hán. Sự suy giảm diệp lục gây mất hiệu suất của hệ thống quang hoá II, thay đổi độ mở khí khổng và rối loạn cân bằng nước ở thực vật, từ đó làm giảm năng suất cây trồng [167]. Ngoài ra, một nguyên nhân khác làm suy giảm - lượng diệp lục là do lượng O2 và H2O2 gia tăng khi thực vật chịu stress hạn, dẫn đến quá trình peroxy hóa lipid [85]. Theo Hao và cs (2013), hàm lượng diệp lục của cây đậu tương bị tác động stress hạn giảm 31% so với cây không bị stress [71]. Hạn hán gây rối loạn chuyển hóa, ức chế sản xuất các sản phẩm quang hợp, phá vỡ sự cân bằng cacbon trong đậu tương [49]. Sự suy giảm hiệu suất của quá trình quang hợp điều kiện khô hạn gây ra giảm tích lũy chất khô và tỷ lệ vỏ quả là nguyên nhân trực tiếp làm giảm năng suất của đậu tương [161]. ii) Tác động của hạn đến khả năng chống oxy hóa Đối với các sinh vật hô hấp hiếu khí, oxy rất cần thiết để duy trì các hoạt động sống. Tuy nhiên, trong quá trình trao đổi chất nếu oxy không được oxy hoá hoàn - toàn sẽ tạo ra một loạt các loại ROS, bao gồm superoxide (O2 ), (H2O2), oxy 1 đơn ( O2), hydroxyl (·OH) và gốc oxy hữu cơ (RO·, ROO·) [104]. Ở điều kiện bình thường, thực vật luôn có sự duy trì sự cân bằng giữa ROS với hệ thống chống oxy hoá. Tuy nhiên, khi bị stress hạn, việc sản xuất và giải phóng ROS bị mất cân bằng. Stress hạn có thể gây ra sự gia tăng các ROS và làm cho các tế bào thực vật bị stress oxy hóa. Khi ROS vượt quá khả năng của hệ thống chống oxy hoá sẽ gây ra sự tích tụ ROS và phá hủy quá trình oxy hóa. Việc sản sinh ra các gốc tự do sẽ dẫn đến một loạt các tác động tế bào học có hại, như peroxy hóa lipid màng sinh học, biến tính protein, đứt gãy sợi DNA và cản trở quá trình quang hợp [169]. Hầu hết các hệ thống bảo vệ của tế bào thực vật được sử dụng để chống lại những tác động bất lợi của các gốc ROS do hạn hán gây ra. Trong trường hợp này, một hệ thống chống oxy hóa nhanh chóng, mạnh mẽ và hiệu quả đóng vai quan
23. ` 10 trọng, then chốt, cung cấp khả năng chịu hạn cho thực vật [80]. Hệ thống này liên quan đến các hoạt động giải độc enzyme và phi enzyme, giúp giảm bớt và sửa chữa tổn thương do các gốc ROS gây ra. Việc tăng cường bộ máy chống oxy hóa giúp loại bỏ các gốc ROS, làm giảm sự rò rỉ điện giải và quá trình peroxy hóa lipid, từ đó duy trì sức sống và tính toàn vẹn của các bào quan và màng tế bào [62]. - - 1 Khi hạn hán, các gốc ROS (O2 , OH , O2 và H2O2) được tạo ra gây nên stress oxy hóa. Tỷ lệ tạo gốc ROS và hoạt động của enzyme chống oxy hóa điều chỉnh trạng thái oxy hóa khử của tế bào. Điều này có thể dẫn đến việc kiểm soát các gốc ROS gây tổn thương tế bào hoặc chết tế bào khi các gốc ROS vượt quá mức sinh lý. Nhiều nghiên cứu thực hiện trong điều kiện thiếu nước cho thấy sự tăng cường hoạt động của các enzyme chống oxy hóa quan trọng như catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) và ascorbate peroxidase (APX) [32], [145]. Trong điều kiện stress hạn, APX tăng cường hoạt tính, tham gia thu hồi các gốc ROS bằng cách sử dụng ascorbate làm chất nền để kích thích sự chuyển đổi H2O2 thành H2O [75]. Sự thay đổi hoạt động APX ở lá phổ biến hơn ở rễ vì APX hoạt động chủ yếu trong lục lạp, tế bào chất và là một enzyme quan trọng để loại bỏ H2O2 trong lục lạp [34]. Theo Wang và cs (2019), hoạt động của các enzyme SOD, POD, CAT và APX được thay đổi và đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây hoa mẫu đơn chống lại tình trạng thiếu nước [159]. Ở cây đậu răng ngựa (Vicia faba L.), các enzyme SOD, CAT và POX cũng được kích thích hoạt động khi gặp stress hạn, giúp giảm mức độ ROS và giảm stress oxy hóa do hạn hán tạo ra [12]. Hàm lượng các enzyme CAT, POD và SOD trong lá tăng khi cây cam thảo (Glycyrrhiza glabra L.) gặp stress hạn giúp ngăn chặn tác hại của H2O2 [76]. iii) Tác động của hạn đến sự trao đổi khoáng Tình trạng thiếu nước thường làm giảm khả năng hấp thụ nguồn khoáng trong đất của rễ, giảm tốc độ vận chuyển chất khoáng ở thân, cuối cùng làm giảm hàm lượng ion trong các mô khác nhau của cơ thể thực vật [91]. Khả năng hấp thụ kali (K) của cây giảm khi gặp điều kiện stress hạn. Sự suy giảm K này là do giảm khả