Luận án Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất Lycopen, Resveratrol và Pycnogenol

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất Lycopen, Resveratrol và Pycnogenol

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HỒ THỊ OANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, XÁC ĐỊNH HÌNH THÁI, CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT CÁC HỆ NANO CHỨA MỘT SỐ HỢP CHẤT LYCOPEN, RESVERATROL VÀ PYCNOGENOL LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2021
2. 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HỒ THỊ OANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, XÁC ĐỊNH HÌNH THÁI, CẤU TRÚC, TÍNH CHẤT CÁC HỆ NANO CHỨA MỘT SỐ HỢP CHẤT LYCOPEN, RESVERATROL VÀ PYCNOGENOL Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2021
3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Mai Hà và TS. Đặng Thị Tuyết Anh. Các kết quả nghiên cứu là trung thực, không trùng lặp và chưa từng công bố trong tài liệu khác. Hà nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Hồ Thị Oanh
4. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè. Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Mai Hà và TS. Đặng Thị Tuyết Anh đã luôn tận tình hướng dẫn, góp ý, chỉ bảo, động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, tập thể cán bộ nghiên cứu phòng Vật liệu tiên tiến, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, bộ phận đào tạo của Học viện đã đào tạo và giúp tôi trau dồi nhiều kiến thức để hoàn thành tốt luận án. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Tập đoàn Vingroup- Công ty CP và chương trình học bổng đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ trong nước của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VinBigdata) đã cấp học bổng cho quá trình thực hiện luận án của tôi. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Hồ Thị Oanh
5. i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 * Mục tiêu của luận án: 2 * Những nội dung nghiên cứu chính của luận án: 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3 1.1.1. Hợp chất lycopen từ trái gấc 3 1.1.1.1. Cấu trúc và tính chất hóa lý của lycopen 5 1.1.1.2. Ưu điểm và hạn chế của lycopen 7 1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết tách lycopen từ quả gấc 8 1.1.2. Hợp chất resveratrol từ cốt khí củ 9 1.1.2.1. Cấu trúc và tính chất hóa lý 11 1.1.2.2. Tác dụng của resveratrol đối với sức khỏe 12 1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết tách resveratrol từ cốt khí củ 13 1.1.3. Pycnogenol từ cây thông đỏ 15 1.1.3.1. Cấu trúc và tính chất hóa lý 15 1.1.3.2. Tác dụng của pycnogenol đối với sức khỏe 16 1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 17 1.2.1. Khái quát về công nghệ nano và vật liệu nano 17 1.2.2. Công nghệ chế tạo vật liệu nano của một số hợp chất có hoạt tính sinh học 18 1.2.3. Một số dạng nano của các hợp chất có hoạt tính sinh học 19 1.2.3.1. Dạng hạt nano 19 1.2.3.2. Dạng nhũ tương nano 20 1.2.3.3. Dạng vi nhũ tương 21 1.2.3.4. Liposome 21
6. ii 1.2.3.5. Dạng micel 22 1.2.3.6. Dạng hạt nano lipid rắn/chất mang nano và dạng chất mang lipid cấu trúc nano 22 1.2.4. Nano lycopen 23 1.2.4.1. Giới thiệu về nano lycopen 23 1.2.4.2. Ứng dụng của nano lycopen 24 1.2.5. Nano resveratrol 25 1.2.5.1. Giới thiệu về nano resveratrol 25 1.2.5.2. Ứng dụng của nano resveratrol 25 1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol 26 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về nano lycopen 26 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về nano resveratrol . 28 1.3.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về hệ lycopen/resveratrol và hệ lycopen/pycnogenol 28 1.3.4. Một số thực phẩm chức năng có liên quan đến hướng nghiên cứu của luận án 31 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 34 2.1. Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 34 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 36 2.2. Thực nghiệm 37 2.2.1. Nghiên cứu chiết tách các hợp chất tự nhiên lycopen và resveratrol sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình chế tạo các dạng hạt nano của chúng 37 2.2.1.1. Chiết tách, tinh chế và bảo quản lycopen từ quả gấc 37 2.2.1.2. Nghiên cứu quá trình chiết tách và tinh chế resveratrol từ rễ cốt khí củ 40 2.2.2. Tổng hợp copolymer PLA-PEG sử dụng làm chất bao bọc vi nang cho quá trình chế tạo hệ nano chứa lycopen 41 2.2.3. Nghiên cứu chế tạo các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol 42 2.2.3.1. Chế tạo nano lycopen và nano resveratrol 42 2.2.3.2. Chế tạo hệ nano tổ hợp chứa lycopen 44
7. iii 2.2.4. Nghiên cứu các phương pháp tạo bột nano 46 2.2.4.1. Phương pháp sấy phun 46 2.2.4.2. Phương pháp đông khô 47 2.2.5. Các phương pháp phân tích định lượng 48 2.2.5.1. Định lượng lycopen và resveratrol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 48 2.2.5.2. Định lượng các hợp chất bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis 49 2.2.6. Đánh giá độ bền của các hạt nano 50 2.2.6.1. Khảo sát sự biến đổi hàm lượng hợp chất của các hạt nano 50 2.2.6.2. Nghiên cứu sự biến đổi hình thái của các hạt nano 51 2.2.7. Các phương pháp phân tích cấu trúc và tính chất của vật liệu 51 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 3.1. Kết quả chiết tách lycopen, resveratrol và tổng hợp copolymer PLA-PEG, sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho quá trình chế tạo các hệ nano 53 3.1.1. Chiết tách lycopen từ màng quả gấc 53 3.1.1.1. Xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình sấy màng gấc 53 3.1.1.2. Xác định dung môi hữu cơ phù hợp để chiết lycopen từ màng gấc khô bằng phương pháp Soxhlet 56 3.1.1.3. Đánh giá cấu trúc và độ tinh khiết của lycopen chiết tách được 57 3.1.1.4. Bảo quản lycopen 63 3.1.2. Chiết tách resveratrol từ rễ cốt khí củ 65 3.1.2.1. Phân tích cấu trúc của resveratrol sau quá trình chiết tách 65 3.1.2.2. Định lượng resveratrol bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 68 3.1.3. Kết quả tổng hợp copolymer PLA-PEG 71 3.2. Kết quả chế tạo các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol 75 3.2.1. Kết quả chế tạo nano lycopen 75 3.2.1.1. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới quá trình chế tạo nano lycopen 75 3.2.1.2. Đánh giá khả năng phân tán trong nước của các mẫu bột nano lycopen 78 3.2.1.3. Phân tích cấu trúc của các mẫu bột nano lycopen 79
8. iv 3.2.1.4. Hình thái và sự phân bố kích thước hạt của nano lycopen 80 3.2.1.5. Đánh giá độ bền của nano lycopen 81 3.2.2. Kết quả chế tạo nano resveratrol 83 3.2.2.1. Đánh giá khả năng phân tán trong nước của các mẫu bột nano resveratrol 83 3.2.2.2. Phân tích cấu trúc của các mẫu bột nano resveratrol 85 3.2.2.3. Hình thái hạt nano resveratrol 85 3.2.2.4. Khảo sát độ ổn định và hình thái hạt nano resveratrol trong các môi trường có độ pH khác nhau 86 3.2.3. Kết quả chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol 90 3.2.3.1. Phân tích cấu trúc hệ nano lycopen/resveratrol 90 3.2.3.2. Đặc điểm hình thái và sự phân bố kích thước hạt của hệ nano lycopen/resveratrol 91 3.2.3.3. Đánh giá độ bền của lycopen trong các mẫu hệ nano lycopen/resveratrol 93 3.2.4. Kết quả chế tạo hệ nano lycopen/pycnogenol 98 3.2.4.1. Phân tích cấu trúc hệ nano lycopen/pycnogenol 98 3.2.4.2. Đánh giá khả năng phân tán của các mẫu bột nano lycopen/pycnogenol 99 3.2.4.3. Hình thái của các mẫu bột nano lycopen/pycnogenol 100 3.2.4.4. Đánh giá hình thái của nano lycopen/pycnogenol trong các môi trường pH khác nhau 101 KẾT LUẬN 105 NHỮNG ĐIỂM MỚI VÀ ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 PHỤ LỤC 122
9. v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ Tiếng Anh Tiếng Việt viết tắt BHT Butylated hydroxytoluene Butylated hydroxyl toluen CDCl3 Chloroform Chloroform DCM Dichloromethane Diclometan DMSO Dimethyl sulfoxide Dimetyl sunfoxide DME Dimethyl ether Dimetyl ether EtOAc Ethyl acetate Ety acetate Fourier Transform Infrared FT-IR Phổ hồng ngoại Spectroscopy High-performance liquid HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography NC Nanocapsule Viên nang nano Mw Molecular weight Khối lượng phân tử Nuclear Magnetic Resonance NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân spectroscopy PEG Polyethylene glycol Polyethylene glycol PLA Polylactic acid Polylactic acid RH40 Cremophor RH 40 Cremophor VTE Tocopherol Vitamin E THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran TEM Transmission electron microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua UV-Vis Ultraviolet–visible spectroscopy Phổ tử ngoại – khả kiến
10. vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. So sánh hàm lượng các carotenoid và giá thành thương mại của chúng 5 Bảng 1.2. Ưu, nhược điểm của một số dạng nano của hợp chất 23 Bảng 1.3. Một số thực phẩm chức năng liên quan đến hướng nghiên cứu của luận án 32 Bảng 2.1. Tỷ lệ mol của PEG và lactide trong các mẫu 42 Bảng 2.2. Thành phần các mẫu nano lycopen 42 Bảng 2.3. Thành phần các mẫu nano resveratrol 43 Bảng 2.4. Thành phần mẫu nano lycopen/resveratrol 44 Bảng 2.5. Thành phần các mẫu nano lycopen/pycnogenol 46 Bảng 3.1. Màu sắc và mùi vị màng gấc khi sấy ở các nhiệt độ khác nhau sau 15 giờ 55 Bảng 3.2. Độ hòa tan của lycopen trong một số dung môi hữu cơ ở nhiệt độ phòng 56 Bảng 3.3. Các tín hiệu đặc trưng trong phổ hồng ngoại của lycopen 57 Bảng 3.4. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của lycopen 59 Bảng 3.5. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ lycopen 62 Bảng 3.6. Kết quả định lượng lycopen trong sản phẩm chiết 63 Bảng 3.7: Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của resveratrol 67 Bảng 3.8. Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ resveratrol 69 Bảng 3.9. Khối lượng phân tử của các mẫu copolymer khối PLA-PEG 72 Bảng 3.10. Kết quả đánh giá khả năng phân tán trong nước của lycopen và các mẫu nano lycopen 78 Bảng 3.11. Độ bền của lycopen trong các mẫu bột nano theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng 82 Bảng 3.12. Kết quả đánh giá khả năng phân tán trong nước của resveratrol và các mẫu nano resveratrol 84 Bảng 3.13. Độ bền của lycopen trong các mẫu bột nano lycopen/resveratrol theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng 94 Bảng 3.14. Độ bền của lycopen trong các hệ nano theo thời gian bảo quản ở -16oC 96
11. vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Quả gấc Việt Nam 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của lycopen 5 Hình 1.3. Các đồng phân của lycopen 6 Hình 1.4. Lycopen dạng bột 7 Hình 1.5. Một số hình ảnh về cây thảo mộc cốt khí củ 10 Hình 1.6. Công thức cấu tạo của trans-resveratrol 11 Hình 1.7. Resveratrol dạng bột 11 Hình 1.8. Công thức cấu tạo của cis-resveratrol 11 Hình 1.9. Tác dụng tích cực của resveratrol đối với sức khỏe 12 Hình 1.10. Hình ảnh cây thông đỏ 15 Hình 1.11. Cấu trúc phân tử của procyanidin (thành phần chính của pycnogenol) 16 Hình 1.12. Pycnogenol dạng bột 16 Hình 1.13. Kích thước vật liệu nano và tế bào 17 Hình 1.14. Hai dạng hạt nano cơ bản: nano hình cầu và viên nang nano 20 Hình 1.15. Cấu trúc của nhũ tương nano 20 Hình 1.16. Cấu trúc của vi nhũ tương nano 21 Hình 1.17. Cấu trúc của liposome 21 Hình 1.18. Cấu trúc của micel 22 Hình 1.19. Cấu trúc của hạt nano lipid rắn/chất mang nano (SLNs) và chất mang lipid cấu trúc nano (NLCs) 22 Hình 1.20. Sơ đồ các loại hệ phân phối lycopen: a- Nhũ tương truyền thống, b- Nhũ tương nano, c- Micel và nhũ tương vi nang, d- Chất mang lipid cấu trúc nano, e- Hydrogel và f- Liposome 24 Hình 1.21. Các hệ vận chuyển nano resveratrol: a- Cyclodetrins, b- Micel, c- Hạt nano lipid rắn/chất mang nano, d- Liposome, e- Hạt nano polymer 25 Hình 1.22. Kích thước và hình thái hạt của micel lycopen: (A)- Giản đồ phân bố kích thước hạt; (B)- Ảnh TEM 26 Hình 1.23. Quá trình chế tạo và đánh giá sự ổn định của lycopen được bao bọc bởi vi nang nano lipid 27 Hình 1.24. Nano lycopen 5% 27
12. viii Hình 2.1. Quy trình sấy màng gấc tươi 37 Hình 2.2. Sơ đồ khối quy trình chiết tách và tinh chế lycopen 39 Hình 2.3. Sơ đồ khối quy trình chiết tách và tinh chế resveratrol 40 Hình 2.4. Sơ đồ tổng hợp khối copolymer PLA-PEG 41 Hình 2.5. Sơ đồ quy trình chung sử dụng để chế tạo bột nano lycopen và nano resveratrol 43 Hình 2.6. Sơ đồ quy trình chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol 45 Hình 2.7. Sơ đồ quy trình chế tạo hệ nano lycopen/pycnogenol 46 Hình 3.1. Sự suy giảm khối lượng của màng gấc khi sấy ở các nhiệt độ khác nhau 53 Hình 3.2. Đồ thị độ ẩm cuối cùng của màng gấc sấy ở các nhiệt độ khác nhau . 54 Hình 3.3. Hình ảnh màng hạt gấc khô sấy ở 60oC trong 15 giờ 56 Hình 3.4. Bột lycopen chiết tách được từ màng gấc khô 57 Hình 3.5. Phổ hồng ngoại của lycopen chiết tách được 58 Hình 3.6. Công thức cấu tạo của lycopen 58 Hình 3.7. Phổ 1H-NMR (A) và 13C-NMR (B) của lycopen chiết tách được 59 Hình 3.8. Phổ UV-Vis của mẫu lycopen chiết tách được (1) và mẫu lycopen chuẩn có độ tinh khiết 98% của Sigma-Aldrich (2) 61 Hình 3.9. Đường chuẩn định lượng lycopen bằng HPLC 62 Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu lycopen chiết tách được khai triển bằng hệ dung môi MeOH:ACN:DCM (10:50:40) 63 Hình 3.11. Phổ UV-Vis của mẫu bột lycopen tinh khiết được bảo quản trong các điều kiện khác nhau : (1)- Mẫu tại thời điểm ban đầu; (2) –Sau 90 ngày bảo quản ở -16oC; (3)- Sau 90 ngày bảo quản ở 4oC; (4)- Sau 90 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng 64 Hình 3.12. Độ bền lycopen bảo quản trong các điều kiện khác nhau theo thời gian: -16oC; 4oC; nhiệt độ phòng (RT) 64 Hình 3.13. Bột resveratrol chiết tách được từ rễ cốt khí củ 65 Hình 3.14. Phổ hồng ngoại của bột resveratrol chiết tách được 66 Hình 3.15. Công thức cấu tạo của resveratrol 66 Hình 3.16. Phổ 1H-NMR (A) và 13C-NMR (B) của resveratrol chiết tách được 68
13. ix Hình 3.17. Phổ UV-Vis của mẫu resveratrol chuẩn (Sigma-Aldrich) (1) và mẫu resveratrol chiết tách được (2) 69 Hình 3.18. Đường chuẩn định lượng resveratrol bằng HPLC 70 Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu resveratrol chiết tách được khai triển bằng hệ dung môi MeOH – H2O + 0,1%Fa = 40 – 60 (v/v) 70 Hình 3.20. Phổ hồng ngoại của PLA và copolymer PLA/PEG 72 Hình 3.21. Công thức cấu tạo của PLA-PEG 73 1 13 Hình 3.22. Phổ H-NMR (A) và C-NMR (B) trong CDCl3 của copolymer PLA-PEG 74 Hình 3.23. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano lycopen theo các tỷ lệ khác nhau giữa lycopen và chất hoạt động bề mặt tween 80 75 Hình 3.24. Giản đồ phân bố kích thước hạt của nano lycopen sử dụng chất hoạt động bề mặt cremophor RH40 và tween 80 76 Hình 3.25: Ảnh TEM của các mẫu (a)- NLy1, (b)- Nly11, (c)- NLy12 và (d)- NLy21 77 Hình 3.26. So sánh khả năng phân tán trong nước của lycopen và các mẫu bột nano lycopen 79 Hình 3.27. Phổ hồng ngoại của các mẫu nano lycopen 80 Hình 3.28. Giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu bột nano lycopen (a) và ảnh TEM của các mẫu (b)-NLy1, (c)- NLy3, (d)- NLy5 81 Hình 3.29. Sự phân hủy của lycopen trong các mẫu bột nano lycopen (a); phổ UV-Vis trong dung dịch THF của các mẫu nano lycopen: (b)- NLy1, (c)- Nly3, (d)- Nly5 sau thời gian bảo quản 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày ở nhiệt độ phòng 82 Hình 3.30. So sánh khả năng phân tán trong nước của resveratrol và các mẫu bột nano resveratrol 84 Hình 3.31. Phổ hồng ngoại của các mẫu nano resveratrol 85 Hình 3.32. Giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu bột nano resveratrol (a) và ảnh TEM của các mẫu (b)-NR1, (c)- NR2, (d)- NR3 86 Hình 3.33. Phổ UV-Vis của mẫu NR1 trong các môi trường: (a)- pH=4,5; (b)- pH=7; (c)- pH=8 và (d)- pH=9 87
14. x Hình 3.34. Sự phân hủy của resveratrol trong các môi trường có độ pH khác nhau 88 Hình 3.35. Giản đồ phân bố kích thước hạt của mẫu NR1 trong môi trường pH 4,5 88 Hình 3.36. Ảnh TEM của mẫu NR1 trong môi trường pH 4,5 89 Hình 3.37. Phổ hồng ngoại của các mẫu hệ nano lycopen/resveratrol 90 Hình 3.38. Phổ UV-Vis của các mẫu nano lycopen/resveratrol trong dung môi THF 91 Hình 3.39. Giản đồ phân bố kích thước hạt (a) và ảnh TEM của các mẫu (b)- S1, (c)- S4, (d)- S7 92 Hình 3.40. Sự phân hủy của lycopen trong các mẫu bột hệ nano lycopen/resveratrol (a); phổ UV-Vis trong dung dịch THF của các mẫu nano lycopen/resveratrol: (b)- S1, (c)- S4, (d)- S7 sau thời gian bảo quản 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày ở nhiệt độ phòng 95 Hình 3.41. Sự phân hủy của lycopen (a); phổ UV-Vis trong dung dịch THF của các mẫu nano lycopen/resveratrol: (b)-S1, (c)-S4, (d)-S7 sau thời gian bảo quản 15 ngày, 30 ngày, 60 ngày và 90 ngày ở -16oC 96 Hình 3.42. Sự phân hủy của lycopen trong các mẫu nano lycopen/resveratrol: (a)- S1, S2 và S3; (c)-S4, S5 và S6; (e)-S7, S8 và S9; phổ UV-Vis trong dung dịch THF của (b)-S1, S2 và S3; (d)- S4, S5 và S6; (f) S7, S8 và S9 tại thời điểm bắt đầu lưu trữ và sau 90 ngày bảo quản ở -16oC 97 Hình 3.43. Phổ hồng ngoại của các mẫu bột nano lycopen/pycnogenol 99 Hình 3.44. Khả năng phân tán trong nước (B) của các mẫu bột nano lycopen/pycnogenol 100 Hình 3.45. Giản đồ phân bố kích thước hạt và ảnh TEM của các mẫu bột nano lycopen/pycnogenol 101 Hình 3.46. Giản đồ phân bố kích thước hạt và ảnh TEM của các mẫu bột nano lycopen/pycnogenol phân tán trong môi trường pH bằng 5 102 Hình 3.47. Giản đồ phân bố kích thước hạt và ảnh TEM của các mẫu bột nano lycopen/pycnogenol phân tán trong môi trường pH bằng 9 103
15. 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế-xã hội, nhu cầu của con người trong lĩnh vực sức khỏe và làm đẹp ngày càng cao dẫn tới sự phát triển mạnh của các sản phẩm thuốc, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Theo xu hướng sử dụng các nguồn nguyên liệu tự nhiên, các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lycopen, resveratrol, pycnogenol, được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, chiết tách và ứng dụng một cách rộng rãi. Lycopen là một carotenoid được tìm thấy trong nhiều loại rau quả màu đỏ như gấc, cà chua, dưa hấu, đu đủ, ổi đỏ, bưởi đỏ [1]. Lycopen có hoạt tính chống oxy hóa cực mạnh, có tác dụng mạnh mẽ trong việc phòng chống ung thư, các bệnh tim mạch, xơ hóa gan và đóng vai trò quan trọng đối với hệ miễn dịch [2,3]. Resveratrol là một stilbenoid kháng độc tố tự nhiên, có nhiều trong cốt khí củ, nho, dứa, đậu phộng và dâu tằm [4]. Tiềm năng ứng dụng của resveratrol là khả năng chống viêm, chống oxy hóa, chữa lành vết thương, chống vi khuẩn và chống ung thư [5, 6]. Pycnogenol được biết đến là một hỗn hợp flavonoid quý cũng có khả năng chống oxy hóa và chống viêm nổi tiếng. Hợp chất giúp tăng cường sức khỏe tim mạch, bảo vệ tế bào thần kinh, kiểm soát các cơn đau và chống lại các gốc tự do [7]. Pycnogenol có nhiều trong vỏ cây thông biển nước Pháp, ngoài ra pycnogenol cũng được tìm thấy trong vỏ đậu phộng, hạt nho và vỏ cây phỉ [8]. Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh học quý nhưng hầu hết các hợp chất nêu trên được xếp vào nhóm hợp chất rất ít tan trong nước và khó hấp thu hiệu quả vào cơ thể, do vậy sinh khả dụng bị hạn chế [9, 10]. Hiện nay, công nghệ nano là một giải pháp hữu hiệu trong việc nâng cao khả năng phân tán, cải thiện sự hấp thu, tăng cường dược tính và nâng cao độ bền của hợp chất [11]. Để khắc phục những nhược điểm về độ hòa tan và độ bền, việc nghiên cứu chế tạo các hợp chất sinh học tự nhiên dưới dạng hạt nano hứa hẹn sẽ tạo ra những nguồn dược liệu quý ứng dụng rộng rãi trong các ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Mặt khác, hiện nay hệ nano chứa ít nhất hai hợp chất tự nhiên đang thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học. Sự kết hợp giữa các hợp chất cho sản phẩm tổ hợp có tác dụng hiệp đồng, mang lại hoạt tính sinh học cao hơn so với việc sử dụng từng hợp chất riêng rẽ. Trong đó, hai hợp chất resveratrol và pycnogenol được biết đến là các hợp chất sinh học có tác dụng tăng độ bền và tăng khả năng
16. 2 phân tán trong nước cho các hợp chất thuộc nhóm carotenoid có nhiều liên kết đôi liên hợp như lycopen. Tuy nhiên cho tới nay, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chế tạo hỗn hợp compozit của các hợp chất mà chưa có công trình công bố chế tạo hệ nano, đặc biệt là hệ nano lycopen/resveratrol và hệ nano lycopen/pycnogenol. Chính bởi vậy, nghiên cứu chế tạo hai hệ nano này là một hướng nghiên cứu mới và cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, luận án tập trung vào: “Nghiên cứu chế tạo, xác định hình thái, cấu trúc, tính chất các hệ nano chứa một số hợp chất lycopen, resveratrol và pycnogenol” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: * Mục tiêu của luận án: - Chiết tách được lycopen từ quả gấc, resveratrol từ cốt khí củ và tổng hợp được copolyme PLA-PEG làm nguyên liệu cho quá trình chế tạo các dạng hạt nano; - Chế tạo được dạng hạt nano và hệ hạt nano như: nano lycopen, nano resveratrol và hệ nano lycopen/resveratrol, hệ nano lycopen/pycnogenol. Xác định được hình thái và cấu trúc của các vật liệu nano thu được; - Đánh giá được độ bền của các vật liệu nano trong các điều kiện bảo quản và môi trường khác nhau. * Những nội dung nghiên cứu chính của luận án: - Nghiên cứu chiết tách lycopen từ quả gấc và resveratrol từ cốt khí củ. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp và phương pháp chiết tách các hợp chất. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của lycopen và resveratrol sau quá trình chiết tách; - Nghiên cứu tổng hợp copolymer PLA-PEG sử dụng làm chất bao bọc vi nang cho các hệ nano tổ hợp chứa lycopen; - Nghiên cứu chế tạo nano lycopen, nano resveratrol có khả năng phân tán tốt trong nước. Xác định hình thái, cấu trúc, tính chất của các mẫu nano bằng các phương pháp phân tích hiện đại. Khảo sát độ bền của bột nano trong các điều kiện bảo quản và môi trường khác nhau; - Nghiên cứu chế tạo hệ nano lycopen/resveratrol và hệ nano lycopen/pycnogenol. Xác định hình thái, cấu trúc và tính chất của các mẫu nano bằng các phương pháp phân tích hiện đại. Nghiên cứu độ bền của lycopen trong các hệ nano theo thời gian bảo quản ở các điều kiện khác nhau.
17. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng các sản phẩm thiên nhiên để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, đặc biệt là ứng dụng thảo dược trong điều trị bệnh và chăm sóc sức khỏe [12]. Các hợp chất sinh học có trong thảo dược là thành phần chính quyết định chất lượng và giá trị của thảo dược. Các hợp chất này có thể được chiết tách từ thân, lá, vỏ cây, hoa, quả, hạt hoặc rễ [13]. Cùng với sự phát triển không ngừng của nền kinh tế-xã hội thì nhu cầu của con người về sức khỏe và thẩm mỹ ngày càng cao, do đó các hợp chất sinh học quý có trong thảo dược ngày càng được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. 1.1.1. Hợp chất lycopen từ trái gấc Gấc (Momordica cochinchinensis Spreng.) là loại trái cây gần gũi với người dân Việt Nam. Dầu gấc, rễ gấc, hạt gấc, ruột gấc đều được sử dụng làm thuốc chữa bệnh [14]. Hình 1.1 là một số hình ảnh về quả gấc. Hình 1.1. Quả gấc Việt Nam Hiện nay, tại Việt Nam, để thuận tiện cho việc sử dụng, bảo quản và vận chuyển, một lượng lớn quả gấc sau thu hoạch được xử lý, tách bỏ vỏ và hạt, sấy nhiệt để tạo màng gấc khô thương phẩm. Màng hạt gấc có chứa một số carotenoid (lutein, beta-cryptoxanthine, zeaxanthine, alpha-carotene, beta-carotene, cis-lycopen và trans-lycopen), vitamin (vitamin C, vitamin E) và một số acid béo (omega-3, omega-6) [15]. Trong đó, nhóm carotenoid chiếm hàm lượng cao và là nguồn dược liệu quý. Theo nghiên cứu của Ishida và cộng sự, màng gấc chứa tổng lượng carotenoid là 5770 ppm, chủ yếu gồm beta-carotene (2710 ppm) và lycopen
18. 4 (3020ppm). Trong đó, hàm lượng β-carotene cao gấp 1,8 lần so với dầu gan cá thu, 10 lần so với cà rốt [16]. Kết quả nghiên cứu của Đại học California khẳng định hàm lượng lycopen trong quả gấc cao gấp 70 lần hàm lượng lycopen có trong cà chua và cao hơn rất nhiều so với các loại rau quả khác [17]. Với những công dụng của các hợp chất trong nhóm carotenoid có trong quả gấc, các nhà khoa học Mỹ gọi loại trái cây này là “Loại quả đến từ thiên đường”. Các hợp chất của beta-carotene, lycopen, alpha-tocopherol có tác dụng làm vô hiệu hóa 75% các chất gây ung thư nói chung, nhất là ung thư vú ở phụ nữ. Hiromitsu Aoki và các cộng sự cũng đã phân tích, đánh giá hàm lượng carotenoid có trong gấc. Kết quả chỉ ra rằng, lycopen và beta-carotene chủ yếu nằm trong màng hạt gấc. Các nhà khoa học cũng nhận định các hợp chất có tác dụng điều trị rất tốt những biến chứng của bệnh tiểu đường [18]. Nhận thấy, các hợp chất chính có trong gấc bao gồm beta-carotene, lycopen, lutein và zeaxanthine đang thu hút được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học. * Lycopen (C40H56; 536,9) * β-Carotene (C40H56; 536.9) * Zeaxanthine (C40H56O2; 568.88) * Lutein (C40H56O2; 568.871) Trong số các hợp chất chính có trong quả gấc thì lycopen là hợp chất có hàm lượng cao nhất và có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người [19]. Chính bởi vậy, giá thành thương mại của lycopen trong thực
19. 5 tiễn khá cao, cao hơn rất nhiều so với các hợp chất khác như β-carotene, zeaxanthine hay lutein (Bảng 1.1) [20]. Cho tới nay, các công trình khoa học mới chỉ thành công trong việc chiết tách lycopen từ quả cà chua ở quy mô thương mại hoặc sản xuất lycopen bằng con đường tổng hợp hóa học [21]. Bảng 1.1. So sánh hàm lượng các carotenoid và giá thành thương mại của chúng Tên Hàm lượng trong quả gấc Giá thương mại Lycopen (>90%) ~ 4000 ppm ~ 110.000.000 đ/kg β-Carotene (>90%) ~ 3000 ppm ~ 9.000.000 đ/kg Zeaxanthine (>90%) ~ 28 ppm ~ 44.000.000 đ/kg Lutein (>90%) ~ 21 ppm ~ 22.000.000 đ/kg 1.1.1.1. Cấu trúc và tính chất hóa lý của lycopen o Cấu trúc phân tử lycopen Lycopen là một tetraterpene và được tổ hợp từ 8 khối isopren, chỉ bao gồm nguyên tử hydro và cacbon [22]. Công thức phân tử của lycopen là C40H56 khối lượng 536 Da (Hình 1.2). Danh pháp IUPAC: (6E,8E,10E,12E,14E,16E,18E, 20E, 22E, 24E, 26E)-2,6,10,14,19,23,27,31-octamethyldotriaconta-2,6,8,10,12,14,16, 18,20,22,24,26,30-tridecaene. Hình 1.2. Công thức cấu tạo của lycopen Thành phần cấu tạo gồm 13 liên kết đôi, trong đó 11 liên kết đôi liên hợp, chính vì vậy lycopen hoạt động như một chất chống lại các tác nhân oxy hóa như tia UV. Lycopen hấp thụ bức xạ có bước sóng dài của ánh sáng khả kiến do đó khi được sử dụng trong mỹ phẩm dưỡng da, nó giúp giảm ảnh hưởng của tia UV lên da, hoặc bảo vệ khỏi các ảnh hưởng ngắn hạn (cháy nắng) và dài hạn (ung thư da) [23]. Tuy nhiên, lycopen dễ bị oxy hóa, nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt do có các liên kết chưa bão hòa trong cấu trúc phân tử [24]. Lycopen có số đồng phân hóa rộng, theo các nghiên cứu lý thuyết nó có 1056 cấu hình cis - trans. Tuy nhiên, chỉ có một vài đồng phân được tìm thấy
20. 6 trong tự nhiên. Đồng phân trans của lycopen là đồng phân phổ biến nhất được tìm thấy trong thực phẩm. Đồng phân 5-cis là ổn định nhất trong tất cả các đồng phân trans, 9-cis, 13-cis, 15-cis, 7-cis và 11-cis. Các đồng phân lycopen được tìm thấy trong huyết tương người, sữa mẹ, và các mô của con người chủ yếu là của đồng phân cis. Màu sắc của lycopen phụ thuộc vào hình thức đồng phân của nó. Các đồng phân trans và hầu hết các đồng phân khác của lycopen có màu đỏ, trong khi tetra-cis của lycopen có màu cam [25, 26]. All trans-Lycopen 15 cis-Lycopen 13 cis-Lycopen 11 cis-Lycopen 9 cis-Lycopen 7 cis-Lycopen 5 cis-Lycopen Tetra-cis-Lycopen Hình 1.3. Các đồng phân của lycopen o Tính chất hóa lý Lycopen dạng bột màu nâu đỏ (Hình 1.4), tan trong các dung môi không phân cực như chloroform, tetrahydrofuran, dichloromethane, n-hexane, benzene,
21. 7 carbon disulfide, acetone, ether dầu hỏa và không tan trong các dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol [27] . Lycopen nhạy cảm với ánh sáng, oxy, nhiệt độ cao và acid [24]. Hình 1.4. Lycopen dạng bột Lycopen kết tinh với tinh thể hình kim màu đỏ tía, không mùi; nhiệt độ nóng chảy: 172 -173oC; hấp thụ cực đại (trong ether dầu hỏa) tại các bước sóng là 361 nm, 444 nm, 470 nm và 502 nm [28]. 1.1.1.2. Ưu điểm và hạn chế của lycopen o Ưu điểm: Lycopen là hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Lycopen kìm hãm sự phát triển của một số căn bệnh ung thư như: ung thư bàng quang, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ruột, ung thư trực tràng và nhồi máu cơ tim [29, 30]. Một số nghiên cứu dịch tễ học đã chứng minh rằng, chế độ ăn giàu lycopen có lợi cho sức khỏe con người. Khả năng chống oxy hóa của lycopen giúp chống lại các bệnh thoái hóa bằng cách trung hòa gốc tự do trong cơ thể, giảm thiểu các tổn thương AND trong các tế bào và cải thiện tế bào chức năng [31]. Lycopen hữu ích cho người có hàm lượng cholesterol cao, xơ vữa động mạch hoặc bệnh tim mạch, phòng tránh các bệnh về rối loạn lipid máu, loãng xương, đóng vai trò quan trọng đối với hệ miễn dịch Hợp chất có tác dụng phòng chữa sạm da, trứng cá, khô da, rụng tóc, nổi sần, dưỡng da, bảo vệ da, giúp da luôn hồng hào, tươi trẻ và mịn màng. Ngoài ra, lycopen có công dụng làm mau lành vết thương, vết bỏng, vết loét [32, 33]. o Hạn chế trong sử dụng lycopen Mặc dù việc sử dụng lycopen mang lại rất nhiều lợi ích, tuy nhiên việc lạm dụng lycopen quá mức có thể dẫn đến một vài tác hại cho sức khỏe. Theo một số
22. 8 nghiên cứu và khảo sát cho thấy, sử dụng lycopen quá nhiều trong một thời gian dài dẫn đến tình trạng da và gan chuyển sang màu vàng cam và nồng độ lycopen trong máu rất cao. Sau 3 tuần thực hiện chế độ ăn kiêng lycopen thì da dẻ đã trở lại bình thường. Sự thay đổi màu da này được gọi là chứng vàng da lycopen. Một vài trường hợp bị dị ứng với lycopen dinh dưỡng, có thể gây ra biếng ăn, tiêu chảy, buồn nôn, đau ngực hay dạ dày, chuột rút, đầy bụng, nôn mửa và mất cảm giác ngon miệng [34]. 1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết tách lycopen từ quả gấc Theo các nghiên cứu của Betty K Ishida (2004), Đặng Thị Tuyết Nhung (2010) và Ciriminna (2016), màng gấc chứa hàm lượng lycopen từ 1,5-3,7 mg/g, cao gấp 70-200 lần hàm lượng lycopen trong cà chua và cao hơn các loại hoa quả khác [35, 36, 37]. Tuy nhiên, cho đến nay, người ta mới chỉ thành công trong việc chiết tách lycopen tinh khiết từ quả cà chua ở quy mô thương mại. Trong một số nghiên cứu công bố, các nhà khoa học đã chiết tách được dầu gấc bằng phương pháp ép, phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn [38]. Sau đó, lycopen được chiết tách từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hóa hoặc sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [39]. Tuy nhiên, những phương pháp này không có hiệu quả kinh tế và không thể triển khai ở quy mô thương mại. Việc chiết tách lycopen từ dầu gấc bằng phương pháp xà phòng hóa tương đối phức tạp, khó phân tách. Dầu gấc sau khi xà phòng hóa không thể hoàn nguyên được và là phế liệu ảnh hưởng đến môi trường. Đối với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC là một phương pháp chỉ thực hiện được trong phòng thí nghiệm, không thể triển khai ở quy mô sản xuất. Năm 2015, PGS.TS. Lê Thị Kim Phụng đã công bố quy trình chiết xuất lycopen và beta-carotene từ màng hạt gấc bằng CO2 siêu tới hạn [40]. Ưu điểm của phương pháp trích ly CO2 siêu tới hạn là có thể tách dung môi siêu tới hạn ra khỏi dịch chiết dễ dàng bằng cách hạ áp suất, hay đối với trường hợp cần sử dụng thêm các dung môi hữu cơ để hỗ trợ cho quá trình trích ly đạt hiệu quả cao hơn thì lượng dung môi thêm vào ít, do đó không gây ảnh hưởng nhiều đến với môi trường. Hệ thống trích ly hoàn toàn kín sẽ hạn chế được sự phân hủy của lycopen bởi ánh sáng và môi trường. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chi phí đầu tư và bảo dưỡng cho thiết bị rất lớn, đắt đỏ, khó thực hiện ở quy mô thương mại.