Luận án Nghiên cứu biểu hiện gen GmDREB6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu biểu hiện gen GmDREB6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen

1. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Phutthakone VACIAXA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmDREB6 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY CHUYỂN GEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, tháng 10/2021
2. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠ I HỌC SƯ PHẠM Phutthakone VACIAXA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmDREB6 NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY CHUYỂN GEN Ngành: Di truyền học Mã s ố: 9420121 LUẬN ÁN TI ẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Chu Hoàng Mậu 2. TS. Phạm Thị Thanh Nhàn Thái Nguyên, tháng 10/2021
3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Phạm Thị Thanh Nhàn (Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên). Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực một phần đã được công bố trên các Tạp chí Khoa học và Công nghệ quốc gia và quốc tế, phần còn lại chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tất cả các nội dung trích dẫn trong luận án đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2021 TÁC GIẢ Phutthakone VACIAXA
4. ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Phạm Thị Thanh Nhàn đã trực tiếp hướng dẫn và thường xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tôi có được sự tự tin và lòng đam mê khoa học giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và cán bộ Bộ môn Di truyền học và Công nghệ sinh học thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn những ý kiến đóng góp quý báu trong các buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô giáo và cán bộ bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án và hoàn thành khoá học này. Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Trường Cao đẳng Sư phạm Khang Khay, Xiêng Khoảng, Lào đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa học tại Việt Nam. Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình, các bạn bè đã luôn động viên, quan tâm, tạo mọi điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2021 TÁC GIẢ Phutthakone VACIAXA
5. iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục . . iii Danh mục bảng trong luận án . . . . vi Danh mục hình trong luận án . . . . vii Danh mục chữ viết tắt trong luận án . ix MỞ ĐẦU . . . 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu . 2 3. Nội dung nghiên cứu 3 4. Những đóng góp mới của luận án 4 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 5 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 6 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN, CHỊUMẶN 6 1.1.1. Cây đậu tương . 6 1.1.2. Đặc tính chống chịu hạn, mặn của cây đậu tương 10 1.1.2.1. Tác động của hạn và cơ chế phân tử của tính chịu hạn 11 1.1.2.2. Tác động của mặn và cơ chế chịu mặn ở cây đậu tương 14 1.2. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB Ở THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU TƯƠNG 20 1.2.1. Đặc điểm của phân họ DREB ở thực vật và cây đậu tương . 20 1.2.2. Vai trò của DREB trong việc điều chỉnh phản ứng với stress phi sinh học ở thực vật . 27 1.2.3. Khả năng chống chịu stress thông qua việc biểu hiệu mạnh nhân tố phiên mã DREB 31
6. iv 1.3. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG 37 1.3.1. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua A. tumefaciens . 37 1.3.2. Nghiên cứu cải thiện khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh ở cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen 41 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 46 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 46 2.1.1. Vật liệu 46 2.1.2. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 48 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48 2.2.1. Nhóm phương pháp phân tích phân họ gen DREB ở cây đậu tương. 48 2.2.2. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật và phân tích hoạt động của vector biển hiện gen GmDREB6 trên cây thuốc lá 49 2.2.3. Nhóm phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen 55 2.2.4. Nhóm phương pháp chuyển gen GmDREB6 vào cây đậu tương 58 2.2.5. Phương pháp phân tích và xử lý dữ liệu . 61 2.3. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN 61 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN . 62 3.1. ĐẶC ĐIỂM VÀ SỰ PHÁT SINH CỦA PHÂN HỌ GEN DREB Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG 62 3.1.1. Kết quả xác định các gen trong phân họ gen DREB ở cây đậu tương . . 62 3.1.2. Sự phát sinh của các thành viên trong phân họ gen GmDREB ở cây đậu tương 65 3.1.3. Cây phát sinh miền AP2 ở đậu tương . . 67
7. v 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN GmDREB6 VÀ PHÂN TÍCH HOẠT ĐỘNG CỦA VECTOR TRÊN CÂY THUỐC LÁ 71 3.2.1.Thiết kết vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB6 71 3.2.2. Biến nạp cấu trúc pBI121_GmDREB6 vào mô cây thuốc lá 76 3.3. PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN GmDREB6, NtP5CS, NtCLC TRÊN CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN BẰNG REAL TIME qRT-PCR 80 3.3.1. Xử lý mặn các dòng thuốc lá chuyển gen GmDREB6 và cây WT 81 3.3.2. Phân tích mức độ biểu hiện của các gen GmDREB6, NtP5CS và NtCLC phản ứng với stress mặn ở các dòng thuốc lá chuyển gen . 81 3.3.3. Thảo luận kết quả biểu hiện gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC ở các dòng thuốc lá chuyển gen . 85 3.4. BIẾN NẠP CẤU TRÚC MANG GEN GmDREB6 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Ở GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22 88 3.4.1. Biến nạp và tạo cây đậu tương chuyển gen GmDREB6 từ giống đậu tương ĐT22 . 88 3.4.2. Phân tích sự hiện diện và sự phiên mã của gen chuyển GmDREB6 trên cây đậu tương chuyển gen 92 3.4.3. Thảo luận kết quả chuyển gen GmDREB6 ở cây đậu tương 93 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 95 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO 98 PHỤ LỤC 122
8. vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Sự biểu hiện quá mức của gen DREB phản ứng với các stress phi sinh học ở các cây chuyển gen 32 Bảng 1.2 Một số gen DREB được sử dụng trong chuyển gen nhằm nâng cao khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học của một số cây trồng và đậu tương 41 Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 50 Bảng 2.2. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá chuyển gen 51 Bảng 2.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR sử dụng trong phân tích cây thuốc lá chuyển gen 52 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR . 53 Bảng 2.5. Trình tự nucleotide của các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng Realtime RT-PCR 57 Bảng 2.6. Môi trường nảy mầm, đồng nuôi cấy, cảm ứng tạo chồi, tái sinh cây chuyển gen ở giống đậu tương ĐT22 59 Bảng 3.1. Số bản copy và vị trí của mỗi gen GmDREB trong hệ gen cây đậu tương 64 Bảng 3.2. So sánh các điểm liên kết trong miền AP2 với sợi DNA vùng promoter của 18 thành viên trong phân họ nhân tố phiên mã DREB ở cây đậu tương . . 69 Bảng 3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121-GmDREB6 vào mô cây thuốc lá 77 Bảng 3.4. Kết quả biến nạp gen GmDREB6 vào giống đậu tương ĐT22 . 91
9. vii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Một số đặc điểm hình thái cây đậu tương (Glycine max) 7 Hình 1.2. Các giai đoạn sinh trưởng của cây đậu tương 8 Hình 1.3. Sơ đồ con đường dẫn truyền tín hiệu trong tế bào khi bị stress mặn ở thực vật bậc cao 16 Hình 1.4. Vị trí của gen GmDREB1 có gene ID: 547622 trên NST số 9 và GmDREB1có gene ID: 547642 trên NST số 14 của cây đậu tương . 26 Hình 1.5. Vị trí của gen GmDREB2 trên NST số 6 của cây đậu tương . 26 Hình 1.6. Vị trí của gen GmDREB6 trên NST số 5 của cây đậu 27 tương Hình 2.1. Hình ảnh của một số giai đoạn phát triển ở giống đậu tương ĐT22 được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen. 44 Hình 3.1. Cây phát sinh và quan hệ tiến hóa giữa các thành viên của phân họ gen DREB ở đậu tương được thiết lập dựa trên trình tự gen GmDREB theo phương pháp Maximum Likelihood và JTT matrix- based model trong MEGAX 66 Hình 3.2. So sánh trình tự amino acid miền AP2 của các protein trong phân họ DREB ở đậu tương 68 Hình 3.3. Cây phát sinh miền AP2 của phân họ protein DREB ở đậu tương được thiết lập dựa trên 69 trình tự amino acid miền AP2 theo phương pháp Maximum Likelihood trong MEGAX và JTT matrix-based model với bootstrap được lặp lại 1000 lần . 70 Hình 3.4. Trình tự nucleotide của gen GmDREB6 nhân tạo 72
10. viii Hình 3.5. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121_GmDREB6. 73 Hình 3.6. Hình ảnh điện di của sản phẩm cắt từ vector pPU18_GmDREB6 và pBI121_GUS với cặp enzyme SacI/XbaI 74 Hình 3.7. Hình ảnh điện di kiểm tra gen chuyển GmDREB6 bằng colony-PCR từ các khuẩn lạc A. tumefaciens AGL1 . 75 Hình 3.8. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121_GmDREB6 được sử dụng để chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 75 Hình 3.9. Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 và tạo cây thuốc lá chuyển gen thông qua A.tumefaciens 76 Hình 3.10. Hình ảnh kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản gen chuyển GmDREB6 từ các cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 . 78 Hình 3.11. Hình ảnh kết quả phân tích Southern blot kiểm tra sự hợp nhất của gen chuyển GmDREB6 vào hệ gen các cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 79 Hình 3.12. Hình ảnh kết quả điện di kiểm tra sản phầm RT-PCR khuếch đại cDNA của gen chuyển GmDREB6 từ mRNA của các cây chuyển gen thế hệ T0 79 Hình 3.13. Hình thái cây thuốc lá chuyển gen GmDREB6 và cây không chuyển gen khi tưới H2O và NaCl trong tủ cấy sau 3 tuần 82 Hình 3.14. Mức độ biểu hiện của gen GmDREB6 ở các dòng thuốc lá chuyển gen trong điều kiện stress mặn bằng phản ứng qRT-PCR sử dụng Actin làm gen tham chiếu. 83 Hình 3.15. Mức độ biểu hiện của các gen NtP5CS ở các dòng thuốc lá chuyển gen GmDREB6 trong điều kiện stress mặn bằng phản ứng qRT-PCR sử dụng Actin làm gen tham chiếu . 84
11. ix Hình 3.16. Mức độ biểu hiện của các gen NtCLC ở các dòng thuốc lá chuyển gen GmDREB6 trong điều kiện stress mặn bằng phản ứng qRT-PCR sử dụng Actin làm gen tham chiếu . 85 Hình 3.17. Hình ảnh quá trình biến nạp và tái sinh cây đậu tương chuyển gen . 90 Hình 3.18. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cấu trúc chứa gen GmDREB6 trong hệ gen các cây đậu tương chuyển gen 92 Hình 3.19. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT- PCR khuếch đại cấu trúc chứa gen GmDREB6 trong hệ gen các cây đậu tương chuyển gen 93 Phụ lục 1. Dữ liệu trình tự gen GmDREB và protein thuộc phân họ DREB của đậu tương sử dụng trong phân tích 123
12. x DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ABA Abscisic Acid Axit Abxixic AS Acetyl seringone bp base pairs Cặp bazơ nitơ cs Cộng sự CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy Ct Threshold of Cycle Chu kỳ ngưỡng DAB 3,3 '-Diaminobenzidine tetrahydrochloride DRE Dehydration Responsive Element Yếu tố điều hoà phản ứng với sự mất nước DREB Dehydration Responsive Element Yếu tố gắn với DRE Binding DPBB Double Psi Beta-Barrel structure Vùng cấu trúc DPBB ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Kỹ thuật ELISA sử dụng trong Assay phân tích hàm lượng protein EST Expressed Sequence Tag Trình tự đánh dấu biểu hiện ETDA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EXP Expansin Protein expansin EXP1 Expansin 1 Gen expansin 1 FAO Food and Agriculture Tổ chức Nông - Lương thế giới Organization GFP Green Fluorescene Protein Protein phát xạ lưu huỳnh GM Germination Medium Môi trường nảy mần
13. xi GmDREB Glycine max DREB gene Gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB ở đậu tương GmEXPl Glycine max expansin gene tươngGen mã hóa enzyme GmEXP1 ở đậu tương GUS P-Glucuronidase IPTG IsoPropylThio - ß – Galaccto side LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn MCS Multi Cloning Site Vùng cắt gắn đa vị MS Murashige và Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng cơ bản trong nuôi cấy in vitro NtCLC Nicotiana tabacum Chloride Gen CLC mã hoá protein là channel gene kênh vận chuyển ion Cl- ở cây thuốc lá NtP5CS Nicotiana tabacum Pyrroline-5- Gen P5CS mã hoá enzyme carboxylate synthetase gen tham gia tổng hợp proline ở OD Optical Density Mcâyật thuđộ ốquangc lá PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase P5CR l-A1-Pyrroline-5-Carboxylate Enzyme tham gia chuỗi phản Reductase ứng tổng hợp proline P5CS l-A1-Pyrroline-5-Carboxylate Enzyme tham gia chuỗi phản Synthetase ứng tổng hợp proline RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ rpm Revolution Per Minute Số vòng/phút RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Phản ứng chuỗi polymerase Chain Reaction phiên mã ngược SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot Induction Medium Môi trường cảm ứng tạo đa T-DNA Transfer DNA chĐoồạin DNA được chuyển vào thực vật
14. xii Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine UTR UnTranslated Region Vùng không dịch mã WT Wild Type Cây không biến nạp, cây không chuyển gen X-gal 5 -bromo-4-chloro-3 -indolyl-beta- D- galacto-pyranoside
15. 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill (2n=40)] thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại cây trồng có vị trí quan trọng trong cơ cấu cây nông nghiệp và trong đời sống của con người của nhiều quốc gia trên thế giới và ở Việt Nam. Đậu tương không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng, mà còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì nhiêu của đất và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác. Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với các tác động của các yếu tố bất lợi phi sinh học và thuộc nhóm cây chịu hạn, mặn kém. Hạn và mặn là các yếu tố phi sinh học nghiêm trọng nhất và có thể làm giảm năng suất đậu tương khoảng 40%, thậm chí đến 90%, đồng thời làm giảm chất lượng hạt. Hiện nay, do biến đổi khí hậu toàn cầu, đặc biệt là hạn kéo dài, lượng mưa không đều ở các thời điểm trong năm và giữa các vùng miền; nước biển dâng xâm lấn đất trồng trọt, gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Do đó, giải pháp chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn, chịu mặn ứng phó với biến đổi khí hậu là vấn đề cấp thiết, có tính thời sự ở Việt Nam cũng như đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Đặc tính chịu hạn, chịu mặn của cây đậu tương do nhiều gen quy định. Sản phẩm của mỗi gen có thể liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chống chịu hạn, mặn như gen liên quan đến tổng hợp proline, sự kéo dài rễ hoặc các gen điều hòa nhóm gen chịu hạn. Nghiên cứu sự biểu hiện các gen điều hòa sự phiên mã của nhóm gen chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học là cách tiếp cận đầy hứa hẹn trong chiến lược phát triển giống đậu tương có
16. 2 khả năng chống chịu tốt các nhân tố phi sinh học, như hạn, mặn, khô, nhiệt Một số gen mã hóa nhân tố phiên mã ở đậu tương đã được mô tả là có phản ứng với tác động của hạn, mặn ở mức phiên mã, trong đó có protein DREB (Dehydration responsive element binding protein). DREB là một phân họ của nhân tố phiên mã AP2/ERF (APETALA2/Ethylene-Responsive), có kiểu tác động trans và có thể liên kết với trình tự cis để kích hoạt biểu hiện gen mục tiêu khi có tín hiệu stress phi sinh học, do đó cải thiện khả năng chịu hạn ở nhiều đối tượng thực vật. Phân họ DREB ở cây đậu tương gồm các thành viên được xác định có trong hệ gen và một số sản phẩm dịch mã của các gen GmDREB đã được khẳng định có chức năng chịu hạn và chịu mặn. Tuy nhiên, một vài thành viên trong phân họ gen DREB chưa được nghiên cứu đầy đủ và làm rõ vai trò của chúng đối với tính chịu hạn, chịu mặn của cây đậu tương, trong đó có gen GmDREB6. Hướng tiếp cận ứng dụng kỹ thuật chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB và làm rõ chức năng của một số gen GmDREB trong hệ gen cây đậu tương nhằm cải thiện đặc tính di truyền, tạo các dòng chuyển gen thích nghi với điều kiện hạn, mặn được đặc biệt quan tâm. Vì vậy, gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB6 liên quan đến tính chống chịu các strees phi sinh học nói chung và tính chịu hạn, mặn nói riêng được lựa chọn làm gen chuyển trong mục đích cải thiện khả năng chịu hạn, chịu mặn của cây đậu tương. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện gen GmDREB6 nhằm nâng cao khả năng chịu mặn ở cây chuyển gen”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Phân tích được đặc điểm của phân họ gen DREB trong hệ gen của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill).
17. 3 2.2. Biểu hiện được protein tái tổ hợp GmDREB6 và đánh giá được chức năng sinh học của gen chuyển GmDREB6 trên cây chuyển gen. 2.3. Biến nạp được cấu trúc mang gen chuyển GmDREB6 vào đậu tương và tạo được cây đậu tương chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu đặc điểm của phân họ gen DREB ở cây đậu tương bằng Tin sinh học 1) Sử dụng Tin sinh học để tìm kiếm các trình tự gen DREB của cây đậu tương trên ngân hàng dữ liệu NCBI. 2) Xác định số lượng gen DREB, vị trí, số bản copy của mỗi gen DREB trong hệ gen cây đậu tương. 3) Xây dựng cây phát sinh chủng loại của phân họ DREB ở đậu tương. 3.2. Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa gen GmDREB6 và phân tích biển hiện gen GmDREB6 trên cây thuốc lá. 1) Nghiên cứu thông tin về gen DREB6 của đậu tương từ ngân hàng dữ liệu NCBI, thiết kế và tổng hợp nhân tạo GmDREB6. 2) Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB6. 3) Phân tích biểu hiện của gen GmDREB6 từ đậu tương trên cây thuốc lá ở mức phiên mã 3.3. Nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen GmDREB6, NtP5CS, NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen bằng Real time qRT-PCR 1) Phân tích biểu hiện gen GmDREB6 từ đậu tương trên cây thuốc lá chuyển gen.
18. 4 2) Phân tích mức độ biểu hiện của gen NtP5CS và NtCLC trên cây thuốc lá chuyển gen GmDREB6. 3.4. Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen GmDREB6 vào cây đậu tương 1) Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp vào lá mầm đậu tương. Tái sinh đa chồi, ra rễ và tạo cây đậu tương chuyển gen. 2) Xác định sự có mặt và sự phiên mã của gen chuyển GmDREB6 trên các cây đậu tương chuyển gen T0. 4. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình nghiên cứu đặc điểm của phân họ gen DREB trong hệ gen cây đậu tương và phân tích biểu hiện gen GmDREB6 trên cây thuốc lá chuyển gen. Những đóng góp mới của luận án được thể hiện cụ thể là: 1) Đã xác định được 18 gen GmDREB thuộc phân họ DREB của cây đậu tương (Glycine max) nằm trên 17 nhiễm sắc thể. Gen GmDREB6 có 8 bản copy, các gen còn lại có từ 1-4 bản copy. Miền AP2 phổ biến có 59-60 amino acid và motif PTPEMAARAYDVAALALKGPSARLNFPEL có ở tất cả các protein DREB của đậu tương. AP2 chứa 11 điểm liên kết với promoter của các gen chức năng phổ biến là RGRRWKERRWT. Cây phát sinh chủng loại của các gen GmDREB và miền AP2 đã thể hiện sự tiến hóa của họ gen này. 2) Sự biểu hiện của gen GmDREB6 từ đậu tương làm tăng mức độ phiên mã của các gen NtP5CS và NtCLC của cây thuốc lá chuyển gen trong điều kiện stress mặn đã được chứng minh bằng thực nghiệm. Trong điều kiện stress mặn, các dòng thuốc lá chuyển gen có mức phiên mã của gen GmDREB6 tăng từ 2,40 đến 3,22 (lần) so với điều kiện không xử lý mặn; mức độ phiên mã
19. 5 của gen NtP5CS tăng từ 1,24 đến 3,60 (lần), của gen NtCLC tăng 3,65 - 4,54 (lần) so với cây WT (P <0,05). 3) Đã biến nạp thành công cấu trúc mang gen chuyển GmDREB6 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua A. tumefaciens tạo được 8 cây đậu tương chuyển gen GmDREB6 dương tính với PCR và 5 cây cho kết quả phân tích RT-PCR. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Kết quả nghiên cứu phân họ gen DREB ở đậu tương đã làm rõ đặc điểm cũng như sự phát sinh của phân họ gen DREB ở cây đậu tương tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu chức năng của các gen DREB trong hệ gen của cây đậu tương. Kết quả phân tích sự biểu hiện mạnh của gen GmDREB6 làm tăng mức độ phiên mã của gen NtP5CS và NtCLC của cây thuốc lá chuyển gen đã chứng minh vai trò của nhân tố phiên mã DREB6 đối với khả năng chịu mặn của cây đậu tương trong điều kiện stress mặn. Vector chuyển gen pBI121_GmDREB6 có thể sử dụng chuyển vào cây đậu tương hoặc các loại cây trồng khác trong mục đích tăng cường khả năng chịu mặn của cây chuyển gen, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ gen vào thực tiễn chọn giống cây trồng. Đồng thời, những kết quả bước đầu tạo cây chuyển gen GmDREB6 đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen tạo ra giống đậu tương chịu mặn góp phần ứng phó với biến đổi khí hậu và hạn mặn thường xuyên xảy ra hiện nay ở Việt Nam. Các bài báo công bố trên các tạp chí khoa học – Công nghệ quốc gia và quốc tế là những tư liệu tham khảo có giá trị trong nghiên cứu, giảng dạy sinh học và công nghệ sinh học.
20. 6 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN, CHỊU MẶN 1.1.1. Cây đậu tương Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu Fabaceae, chi Glycine, là một loại cây trồng được biết đến từ rất lâu. Các bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học chỉ ra rằng đậu tương có nguồn gốc từ Trung Quốc xuất hiện vào khoảng thế kỷ XVII trước công nguyên, sau đó loại cây này được ở nhiều nước Châu Á Châu Âu và Hoa Kỳ. Hệ thống phân loại đậu tương dựa vào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể. Chi Glycine được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài đậu tương trồng Glycine (L.) Merr và loài hoang dại hàng năm Glycine Soja Sieb và Zucc [2]. Về đặc điểm thực vật học, đậu tương là cây thân thảo, tự thụ phấn, cây trồng cạn thu hạt, gồm thân, rễ, lá, hoa, quả và hạt (Hình 1.1). Từ lúc nảy mầm đến khi cây có 5 lá thật (3 lá kép) khoảng 25-30 ngày sau khi gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường. Khi cây đã có 6-7 lá thật (4-5 lá kép) thân bắt đầu phát triển mạnh, tốc độ mạnh nhất vào lúc ra hoa rộ (Hình 1.2). Sự khác biệt của cây đậu tương với cây trồng khác là khi cây ra hoa rộ lại là lúc thân cành phát triển mạnh nhất. Đây là giai đoạn 2 quá trình sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng thiếu dinh dưỡng, cho nên cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước khi vào thời kỳ này và tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển thuận lợi.
21. 7 Hình 1.1. Một số đặc điểm hình thái cây đậu tương (Glycine max) A: Hình vẽ mô tả hình thái cây đậu tương [149]; B: Mẫu ép đậu tương [150]; C: Hoa đậu tương; D: Nốt sần đậu tương; E: Cây đậu tương, quả và hạt; F: Hạt đậu tương [151] Rễ đậu tương gồm có rễ cái và nhiều rễ con, rễ cái do phôi phát triển thành và có thể ăn sâu tới 150 cm, thông thường chỉ ăn sâu 20 – 30 cm. Từ rễ cái mọc ra nhiều rễ con. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết quả của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài 1cm, đường kính 5 – 6 mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt sần có màu đỏ hồng thì có khả năng cố định nitơ mạnh, nếu nốt sần cắt ngang có màu đen là không còn khả năng cố định nitơ [2].
22. 8 Hình 1.2. Các giai đoạn sinh trưởng của cây đậu tương [151] Thân cây đậu tương có nhiều lông nhỏ và nhiều đốt, lá mọc từ các đốt, cành mọc từ nách lá. Thân cây có màu xanh, xanh nhạt, tím nhạt. Chiều cao thân dao động từ 20 – 50 cm, có thể lên tới 150 cm và được chia làm nhiều loại như thân đứng, bán đứng, leo. Dựa vào sự sinh trưởng của thân chia thành các loại là sinh trưởng hữu hạn (thân ngừng phát triển khi quả chín), sinh trưởng bán hữu hạn (quả sắp chín thân vẫn tiếp tục dài ra) và loại hình trung gian [2]. Lá đậu tương có 3 loại: lá mầm, lá đơn và lá kép có 3 lá chét. Lá có thể có hình quả xoan, ngọn giáo, trứng. Màu xanh của lá có ảnh hưởng đến sản lượng quả, lá nằm cạnh hoa nào thì có quyết định đến chính chùm hoa, quả đó. Độ góc sắp xếp lá trên cây có ý nghĩa quan trọng, độ góc hẹp lá sắp xếp thẳng góc với tia sáng thì có khả năng tận dụng được nhiều năng lượng mặt trời và có thể trồng dày để thu năng suất cao [2]. Cành trên thân thay đổi tùy theo giống, thời vụ và điều kiện canh tác. Cành mọc từ đốt thứ nhất tới đốt thứ 12, mọc khỏe từ đốt thứ 5 - 6. Giống chín sớm vụ xuân có thể không có cành hoặc chỉ có từ 1 - 2 cành, các giống chín muộn vụ hè có từ 4 - 6 cành. Trong chọn tạo giống mục tiêu chọn ra các
23. 9 giống có số cành cấp 1 trên cây nhiều để tăng năng suất. Một số vùng trồng đậu tương áp dụng biện pháp ngắt ngọn khi cây có 4- 5 lá để tăng khả năng phân cành [2]. Hoa đậu tương được phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân, hoa có màu tím, tím nhạt, trắng. Hoa đậu tương rất bé, có chiều dài 6 -7mm và mọc thành chùm. Hoa có cấu tạo dạng cánh bướm đặc trưng với ống đài 5 cánh không bằng nhau và tràng hoa bao gồm cánh cờ phía sau, 2 cánh bên và 2 cánh phía trước tiếp xúc nhau. Bộ nhị hoa gồm 10 nhị chia thành 2 nhóm, nhóm 1 gồm 9 nhị với cuống đính với nhau thành một khối và nhóm 2 nhị chỉ có 1 nhụy hoa, nhụy hoa có 1 lá noãn và từ 1 đến 4 lá noãn đính. Hoa ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30% có khi lên tới 80% [2]. Quả đậu tương thuộc loại quả giáp, số quả trên cây tuỳ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh, số quả trên cây dao động từ 10 - 20 quả với các giống chín sớm, các giống chín trung bình và chín muộn thì số quả trên cây nhiều hơn, có thể lên tới 150 quả/cây. Mỗi quả có từ 1 - 4 hạt nhưng chủ yếu là 2 - 3 hạt. Hạt thường có dạng hình tròn, dẹt, bầu dục. Màu sắc hạt có thể là vàng, vàng rơm, xanh, hoặc màu đen như một số giống nhập nội. Giống có hạt màu vàng giá trị thương phẩm cao. Trong hạt, phôi thường chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt. Các giống có rốn hạt màu trắng được ưa chuộng hơn các giống có rốn hạt màu đen, nâu. Khối lượng 1000 hạt thay đổi tuỳ theo giống và điều kiện canh tác, có thể dao động từ 50 - 400g [2]. Khi các hạt đã rắn dần và đạt đến độ chín sinh lý vỏ hạt có màu sắc đặc trưng của giống, còn vỏ quả thì chuyển sang màu vàng, vàng tro, xám, lá cây cũng chuyển sang úa vàng và rụng dần. Hàm lượng dầu trong hạt được ổn định sớm lúc hạt đang phát triển nhưng hàm lượng protein thì vẫn còn chịu ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng của cây cho đến cuối thời kì của quá trình chín [2].
24. 10 Các nhân tố sinh thái cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương. Đất trồng thích hợp nhất là đất thịt nhẹ, tơi xốp, sẫm màu, thoáng, thoát nước, pH từ 6,5- 7,2. Thời kỳ mọc nhiệt độ thích hợp nhất là 18- 22 oC, phạm vi nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho thời kỳ mọc là 10 oC và 40 oC. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng cành lá là 20- 23 oC, thấp nhất là 15 oC, cao nhất là 37oC. Nhiệt độ dưới 10 oC ngăn cản sự phân hoá hoa, dưới 18oC đã có khả năng làm cho quả không đậu. Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ ra hoa là 22- 25 oC. Nhiệt độ thích hợp nhất cho thời kỳ hình thành quả và hạt là 21- 23 oC, thấp nhất là 15 oC cao nhất là 35 oC. Thời kỳ chín nhiệt độ thích hợp nhất là 19- 20 oC. Nhiệt độ 25- 27 oC hoạt động của vi khuẩn nốt sần tốt nhất. 1.1.2. Đặc tính chống chịu hạn, mặn của cây đậu tương Các tác động bất lợi từ ngoại cảnh hay những stress có thể là nhân tố sinh học hoặc phi sinh học. Các stress phi sinh học thường xuyên tác động đến thực vật nói chung, cây đậu tương nói riêng. Những yếu tố môi trường gây ra stress là úng nước, hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, đất mặn, thiếu chất dinh dưỡng trong đất; ánh sáng, gió, kim loại nặng và tổn thương cơ học. Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với stress phụ thuộc vào đặc tính của loài, kiểu gen, các giai đoạn phát triển của thực vật. Những phản ứng của thực vật đối với các tác động của các stress thể hiện ở sự thay đổi biểu hiện gen, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi tỉ lệ sinh trưởng và năng suất. Thời gian, mức độ khốc liệt của stress ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của cây trồng. Tính chống chịu là khả năng của thực vật ngăn ngừa, kháng lại và chịu đựng được các tác động bất lợi từ ngoại cảnh. Có ba dạng chống chịu các
25. 11 stress phi sinh học, đó là khả năng tránh stress (stress avoidance), khả năng kháng stress (stress tolerance) và khả năng chịu đựng được các stress. 1.1.2.1. Tác động của hạn và cơ chế phân tử của tính chịu hạn Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong tự nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cơ thể thực vật. Hạn cũng như những yếu tố ngoại cảnh khác khi tác động lên cơ thể, gây ra các phản ứng của cơ thể, tùy theo từng loài, giống mà mức độ phản ứng của cơ thể cũng như thiệt hại khô hạn gây ra khác nhau: một số bị chết, một số bị tổn thường, một số khác bị ảnh hưởng, còn số khác có thể không bị ảnh hưởng Hiện tượng khô xảy ra khi mất một phần nước trong các cơ quan ở giai đoạn nhất định của chu kì sống ở thực vật (hạt, bào tử). Hiện tượng này không làm ảnh hưởng đến tế bào, mô của cây. Đây là quá trình biến đổi trạng thái trong tế bào có sự điều khiển của hệ thống thông tin di truyền. Trong giai đoạn hình thành hạt, tế bào bị mất nước, khả năng chịu hạn tăng lên. Khả năng này đạt cực đại ở thời kì hạt chín và có chiều hướng giảm dần khi hạt nảy mầm. Hạt khô còn có khả năng chống chịu với hàng loạt các điều kiện ngoại cảnh bất lợi khác như nhiệt độ, gió [9]. Hạn do tác động của môi trường gây ảnh hưởng đến đời sống của cây, có thể dẫn đến hủy hoại cây cối và mất mùa. Hiện tượng này xảy ra khi trong môi trường đất và không khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy nước vào tế bào. Những yếu tố bất lợi này chính là các thành phần như thổ nhưỡng, nhiệt độ, gió nóng hay thời tiết và khí hậu. Có thể phân biệt hai loại hạn do môi trường tác động, đó là hạn đất và hạn không khí. Hạn đất thường xảy ra những vùng có khí hậu hay thổ nhưỡng đặc thù, hạn đất tác động mạnh lên bộ rễ của cây. Sự tác động này được biểu
26. 12 hiện qua sự điều tiết các hormon giúp cho cây chống chịu được điều kiện cực đoan [11]. Hạn không khí, nhiệt độ thường xảy ra ở những vùng gió, nhiệt độ cao. Hạn không khí thường tác động chủ yếu lên các bộ phận bên trên mặt đất như lá, hoa Hạn do tác động của môi trường dẫn đến hiện tương mất nước trong cây ở các bộ phận mô, tế bào khác nhau [9]. Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính: làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây. Nước là yếu tố giới hạn đối với cây trồng, vừa là sản phẩm khởi đầu vừa là sản phẩm trung gian và cuối cùng các quá trình chuyển hóa sinh học. Nước là môi trường để các phản ứng trao đổi chất xảy ra, do vậy việc cung cấp nước cho cây trồng là mục tiêu tạo giống chống chịu thường xuyên được quan tâm. Mức độ thiếu hụt nước càng lớn thì càng ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Nếu thiếu nước nhẹ sẽ làm giảm tốc độ sinh trưởng, thiếu nước trầm trọng sẽ làm biến đổi hệ keo nguyên sinh chất làm tăng cường quá trình già hóa tế bào khi bị khô kiệt nước, nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào, mô bị tổn thương và chết. Đối với thực vật nói chung và cây trồng nói riêng, hạn ảnh hưởng mạnh và gây hậu quả nghiệm trọng đến hai giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây, đó là giai đoạn cây non và giai đoạn ra hoa [9]. Như vậy, ảnh hưởng cực đoan của hạn ở bất cứ giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng cũng tác động đến các yếu tố cấu thành năng suất, làm giảm năng suất của cây trồng. Stress phi sinh học là nguyên nhân chính dẫn đến mất mùa trên toàn thế giới, gây ra thiệt hại đến năng suất bình quân hơn 50% ở nhiều loại cây trồng. Trong số các stress phi sinh học, hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất cây trồng. Stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội môi và phân bố ion trong tế bào [147]. Cây trồng phản ứng với các stress hạn thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào như tổng hợp các protein stress, tăng cường các chất chống oxy hóa, tích lũy các chất tan [37]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy,