Luận án Mối liên kết giữa đa hình một số gen ứng viên với tính trạng tăng khối lượng, dày mỡ lưng và tỷ lệ mỡ giắt ở lợn duroc

Nội dung text: Luận án Mối liên kết giữa đa hình một số gen ứng viên với tính trạng tăng khối lượng, dày mỡ lưng và tỷ lệ mỡ giắt ở lợn duroc

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIÊṆ CHĂN NUÔI HOÀNG THỊ THÚY MỐI LIÊN KẾT GIỮA ĐA HÌNH MỘT SỐ GEN ỨNG VIÊN VỚI TÍNH TRẠNG TĂNG KHỐI LƢỢNG, DÀY MỠ LƢNG VÀ TỶ LỆ MỠ GIẮT Ở LỢN DUROC NGÀNH: Di truyền và Chọn giống vật nuôi MÃ SỐ: 9 62 01 08 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Phạm Doãn Lân 2. TS. Đoàn Văn Soạn HÀ NỘI, 2021
2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng Ďƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Nghiên cứu sinh Hoàng Thị Thúy i
3. LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi Ďã nhận Ďƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp Ďỡ, Ďộng viên của bạn bè, Ďồng nghiệp và gia Ďình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi Ďƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc TS. Phạm Doãn Lân và TS. Đoàn Văn Soạn Ďã tận tình hƣớng dẫn, Ďƣa ra nhiều ý kiến Ďóng góp quý báu, dành nhiều công sức, thời gian và tạo Ďiều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện Ďề tài. Tôi xin cảm ơn tới Lãnh Ďạo và các cán bộ Phòng thí nghiệm trọng Ďiểm Công nghệ tế bào Ďộng vật Viện Chăn nuôi Ďã tạo Ďiều kiện, hƣớng dẫn và giúp Ďỡ trong quá trình nghiên cứu Ďể hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Công ty TNHH lợn giống hạt nhân Dabaco Ďã tạo mọi Ďiều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin cảm ơn Ban Giám Ďốc, Phòng Khoa học, Đào tạo và Hợp tác quốc tế Viện Chăn nuôi Ďã tạo mọi Ďiều kiện và giúp Ďỡ trong quá trình học tập nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nông - Lâm Bắc Giang Ďã giúp Ďỡ và tạo Ďiều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện Ďề tài. Xin chân thành cảm ơn gia Ďình, ngƣời thân, bạn bè, Ďồng nghiệp Ďã tạo mọi Ďiều kiện thuận lợi và giúp Ďỡ tôi về mọi mặt, Ďộng viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./ Nghiên cứu sinh Hoàng Thị Thúy ii
4. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 2.1. Mục tiêu chung 3 2.2. Mục tiêu cụ thể 3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 5 1.1.1. Chọn lọc giống vật nuôi dựa vào sự hỗ trợ của gen ứng viên và chỉ thị di truyền 5 1.1.2. Một số phƣơng pháp nghiên cứu Ďa hình di truyền 7 1.1.3. Đặc Ďiểm giống lợn Duroc 16 1.2. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GEN ỨNG VIÊN 18 1.2.1. Bộ gen của lợn 18 1.2.2. Gen MC4R (Manocortin-4 Receptor) 19 1.2.3. Gen PIT1 (Pituitary-specific transcription factor) 19 1.2.4. Gen GH (Growth hormone) 21 1.2.5. Gen LEP (Leptin) 22 1.2.6. Gen PIK3C3 (Class 3 phosphoinositide-3-kinase) 24 1.2.7. Gen FABP3 (Fatty acid binding protein) 24 iii
5. 1.2.9. Gen PLIN2 (Perilipin 2) 26 1.2.10. Gen ACSL4 (Acyl coA synthetase) 27 1.3. MỠ GIẮT VÀ VAI TRÒ CỦA MỠ GIẮT 28 1.3.1. Khái niệm mỡ giắt 28 1.3.2. Lợi ích cung cấp từ mỡ giắt 29 1.4. KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA LỢN VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG 31 1.4.1. Các chỉ tiêu Ďánh giá khả năng sinh trƣởng 31 1.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng Ďến sinh trƣởng 32 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 35 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 35 1.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc 40 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 45 2.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 45 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 45 2.4. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.4.1. Đánh giá khả năng sinh trƣởng của lợn Duroc 45 2.4.2. Phƣơng pháp phân tích Ďa hình di truyền các gen ứng viên 46 2.4.3. Mối liên kết giữa Ďa hình gen MC4R, PIT1, GH, LEP và PIK3C3 với tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng 51 2.4.4. Năng suất sinh sản và mối liên kết của các Ďa hình gen MC4R, PIT1, GH, LEP và PIK3C3 với tính trạng sinh sản 52 2.4.5. Mối liên kết giữa Ďa hình gen ADRB3, ACSL4, FABP3 và PLIN2 với tính trạng mỡ giắt 53 2.4.6. Chọn lọc Ďàn lợn Duroc theo hƣớng tăng khối lƣợng dựa trên kiểu gen 55 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 3.1. KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA LỢN DUROC 56 iv
6. 3.2. ĐA HÌNH GEN MC4R, PIT1, GH, LEP VÀ PIK3C3 59 3.2.1. Nồng Ďộ và Ďộ tinh sạch của mẫu ADN 59 3.2.2. Nhân ADN Ďặc hiệu của gen MC4R, PIT1, GH, LEP và PIK3C3 60 3.2.3. Đa hình các Ďoạn gen MC4R, PIT1, GH, LEP và PIK3C3 62 3.3. MỐI LIÊN KẾT CỦA ĐA HÌNH GEN MC4R, PIT1, GH, LEP VÀ PIK3C3 VỚI TĂNG KHỐI LƢỢNG, DÀY MỠ LƢNG 74 3.3.1. Mối liên kết của gen MC4R với tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng 74 3.3.2. Mối liên kết của gen PIT1 với tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng 78 3.3.3. Mối liên kết của gen GH với tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng 80 3.3.4. Mối liên kết của gen LEP với tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng 83 3.3.5. Mối liên kết của gen PIK3C3 với tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng . 86 3.3.6. Năng suất sinh sản và mối liên kết giữa hình gen MC4R, PIT1, GH, LEP với tính trạng sinh sản 88 3.4. ĐA HÌNH GEN ADRB3, ACSL4, FABP3 VÀ PLIN2 96 3.4.1. Kết quả nhân ADN Ďặc hiệu 96 3.4.2. Đa hình các gen ADRB3, ACSL4, FABP3 (HinfI), FABP3 (BsrfI) và PLIN2 98 3.5. MỐI LIÊN KẾT GIỮA ĐA HÌNH CỦA GEN ACSL4, ADRB3, PLIN2 VÀ FABP3 (HinfI) VỚI TỶ LỆ MỠ GIẮT 108 3.5.1. Mối liên kết của gen ACSL4 với tỷ lệ mỡ giắt 108 3.5.2. Mối liên kết của gen ADBR3 với tỷ lệ mỡ giắt 108 3.5.3. Mối liên kết của gen PLIN2 với tỷ lệ mỡ giắt 110 3.5.4. Mối liên kết của gen FABP3 (HinfI) với tỷ lệ mỡ giắt 110 3.6. CHỌN LỌC ĐÀN LỢN DUROC THEO HƢỚNG TĂNG KHỐI LƢỢNG DỰA TRÊN KIỂU GEN 113 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 115 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 v
7. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết Tiếng Việt Tiếng Anh tắt µl Mi crô lít Microliter ADN Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid Amplified fragment length AFLP Đa hình Ďộ dài Ďoạn nhân chọn lọc polymorphism ARN Axit ribonucleic Ribonucleic acid bp Cặp Bazơ Base pair cm Cen ti mét Centimet cs. Cộng sự et al DLY Duroc × (Landrace × Yorkshire) Duroc × (Landrace × Yorkshire) DML Dày mỡ lƣng backfat thickness GLM Mô hình tuyến tính tổng quát General Linear Model kg Ki lô gam Kilogram KLbĎKT Khối lƣợng bắt Ďầu kiểm tra Pre-test weight KLktKT Khối lƣợng kết thúc kiểm tra Post-test weight LSM Trung bình bình phƣơng nhỏ nhất Least Square Mean PCR Phản ứng khuyếch Ďại gen Polymerase Chain Reaction QTL Tính trạng số lƣợng Quantitative Trait Locus Random amplified RAPD Đa hình ADN nhân ngẫu nhiên polymorphism DNA Kỹ thuật Ďa hình Ďộ dài Ďoạn cắt Restriction fragment length RFLP hạn chế polymorphism Single Nucleotide SNP Đa hình nucleotide Ďơn Polymorphism STS Vị trí chuỗi Ďánh dấu Sequencetagged Sites TA Thức ăn Food TKL Tăng khối lƣợng trung bình ngày Average daily gain TLMG Tỷ lệ mỡ giắt Intramuscular fat TTTA Tiêu tốn thức ăn Food consumed vi
8. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự và thông tin các cặp mồi 48 Bảng 2.2. Số lứa Ďẻ của 104 nái Duroc 52 Bảng 3.1. Kết quả theo dõi kiểm tra năng suất lợn Duroc 56 Bảng 3.2. Tần số các kiểu gen và alen trên Ďoạn gen MC4R 63 Bảng 3.3. Tần số các kiểu gen và alen trên Ďoạn gen PIT1 65 Bảng 3.4. Tần số các kiểu gen và alen trên Ďoạn gen GH 68 Bảng 3.5. Tần số các kiểu gen và alen Ďa hình trên Ďoạn gen LEP 71 Bảng 3.6. Tần số các kiểu gen và alen Ďa hình trên Ďoạn gen PIK3C3 73 Bảng 3.7. Mối liên kết của kiểu gen MC4R với các chỉ tiêu sinh trƣởng 74 Bảng 3.8. Mối liên kết của kiểu gen PIT1 với các chỉ tiêu sinh trƣởng 78 Bảng 3.9. Mối liên kết của kiểu gen GH với các chỉ tiêu sinh trƣởng 81 Bảng 3.10. Mối liên kết của kiểu gen LEP với các chỉ tiêu sinh trƣởng 83 Bảng 3.11. Mối liên kết của kiểu gen PIK3C3 với các chỉ tiêu sinh trƣởng 87 Bảng 3.12. Năng suất sinh sản của lợn nái Duroc 88 Bảng 3.13. Liên kết Ďa hình gen MC4R với tính trạng sinh sản 90 Bảng 3.14. Liên kết Ďa hình gen PIT1 với tính trạng sinh sản 91 Bảng 3.15. Liên kết Ďa hình gen GH với tính trạng sinh sản 93 Bảng 3.16. Liên kết Ďa hình gen LEP với tính trạng sinh sản 95 Bảng 3.17. Tần số kiểu gen và alen Ďa hình trên Ďoạn gen ADBR3 99 Bảng 3.18. Tần số các kiểu gen và alen Ďa hình trên Ďoạn gen ACSL4 101 Bảng 3.19. Tần số các kiểu gen và alen Ďa hình trên Ďoạn gen FABP3 (HinfI) . 103 Bảng 3.20. Tần số các kiểu gen và alen Ďa hình trên Ďoạn gen FABP3 (BsrfI) . 104 Bảng 3.21. Tần số các kiểu gen và alen Ďa hình trên Ďoạn gen PLIN2 106 Bảng 3.22. Mối liên kết của gen ACSL4 với TLMG 108 Bảng 3.23. Mối liên kết của gen ADBR3 với TLMG 109 Bảng 3.24. Mối liên kết của gen PLIN2 với TLMG 110 Bảng 3.25. Mối liên kết của gen FABP3 (HinfI) với TLMG 110 Bảng 3.26. Khả năng sinh trƣởng của lợn Duroc thế hệ 1,2 mang Ďồng thời hai kiểu gen AA (gen MC4R) và AA (gen PIT1) 113 vii
9. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Giống lợn Duroc 17 Hình 1.2. Bộ nhiễm sắc thể của lợn 18 Hình 1.3. Vị trí MC4R trên NST số 1 - NC_010443.5 19 Hình 1.4. Vị trí PIT1 trên NST số 13 - NC_010455.5 20 Hình 1.5. Vị trí GH trên NST số 12- NC_010454.4 21 Hình 1.6. Vị trí LEP trên NST số 18 - NC_010460.4 23 Hình 1.7. Vị trí PIK3C3 trên NST số 6 - NC_010448.4 24 Hình 1.8. Vị trí FABP3 trên NST số 6 - NC_010448.4 25 Hình 1.9. Vị trí ADRB3 trên NST số 15 - NC_010457.5 26 Hình 1.10. Vị trí PLIN2 trên NST số 1 - NC_010443.5 27 Hình 1.11. Vị trí ACSL4 trên NST X- NC_010461.5 27 Hình 3.1. Một số chỉ tiêu sinh trƣởng của lợn Duroc 58 Hình 3.2. Kết quả Ďiện di kiểm tra ADN trên gel agarose 2% 59 Hình 3.3. Kiểm tra nồng Ďộ ADN 59 Hình 3.4. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen MC4R 60 trên gel agarose 2% 60 Hình 3.5. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen PIT1 60 trên gel agarose 2% 60 Hình 3.6. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen GH 61 trên gel agarose 2% 61 Hình 3.7. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen PIK3C3 61 trên gel agarose 2% 61 Hình 3.8. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen LEP 61 trên gel agarose 2% 61 Hình 3.9. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen MC4R bằng enzyme TaqI 62 Hình 3.10. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen MC4R 63 Hình 3.11. Tần số các kiểu gen AA, AG, GG của gen MC4R ở thế hệ 1 và 2 64 viii
10. Hình 3.12. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen PIT1 bằng enzyme RasI 65 Hình 3.13. Tần số các kiểu gen AA, AB, BB của gen PIT1 ở 66 thế hệ 1 và 2 66 Hình 3.14. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen GH bằng enzyme FokI 67 Hình 3.15. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen GH 68 Hình 3.16. Tần số kiểu gen AA, AG, GG của gen GH ở thế hệ 1 và 2 69 Hình 3.17. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen LEP bằng enzyme HinfI 70 Hình 3.18. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen LEP 70 Hình 3.19. Tần số các kiểu gen CT, CC của gen LEP ở thế hệ 1 và 2 72 Hình 3.20. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình PIK3C3 bằng enzyme Hpy8I 72 Hình 3.21. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen PIK3C3 73 Hình 3.22. Tăng khối lƣợng của lợn Duroc mang các kiểu gen AA, AG, GG của gen MC4R ở thế hệ thứ 1 và 2 75 Hình 3.23. Tăng khối lƣợng của lợn Duroc mang các kiểu gen AA, AB, BB của gen PIT1 ở thế hệ thứ 1 và 2 80 Hình 3.24. Tăng khối lƣợng của lợn Duroc mang các kiểu gen AA, AG, GG của gen GH ở thế hệ thứ 1 và 2 82 Hình 3.25. Tăng khối lƣợng của lợn Duroc mang các kiểu gen CT, TT của gen LEP ở thế hệ 1 và 2 85 Hình 3.26. Số con sơ sinh/ổ của lợn Duroc mang kiểu gen AA, AG và GG của gen MC4R 91 Hình 3.27. Khối lƣợng cai sữa/ổ của lợn Duroc mang kiểu gen AA, AB và BB của gen PIT1 93 Hình 3.28. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen ADRB3 trên gel agarose 2% 96 Hình 3.29. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen ACSL4 97 trên gel agarose 2% 97 Hình 3.30. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen FABP3 (HinfI) trên gel agarose 2% 97 ix
11. Hình 3.31. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen FABP3 (BsrfI) trên gel agarose 2% 97 Hình 3.32. Kết quả Ďiện di sản phẩm PCR của gen PLIN2 98 trên gel agarose 2% 98 Hình 3.33. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen ADRB3 bằng enzyme TaqI 98 Hình 3.34. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen ADRB3 99 Hình 3.35. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen ACSL4 bằng enzyme RsaI 100 Hình 3.36. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen ACSL4 101 Hình 3.37. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen FABP3 bằng enzyme HinfI 102 Hình 3.38. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen FABP3 (HinfI) 102 Hình 3.39. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen FABP3 bằng enzyme BsrfI104 Hình 3.40. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen FABP3 ((BsrfI) 104 Hình 3.41. Phổ Ďiện di phân tích Ďa hình gen PLIN2 bằng enzyme Mva1269I 105 Hình 3.42. Kết quả giải trình tự các Ďiểm Ďa hình gen PLIN2 106 Hình 3.43. Tần số kiểu gen của các gen ADBR3, ACSL4, FABP3 (HinfI), FABP3 (BsrfI), PLIN2 107 Hình 3.44. Tần số alen của các gen ADBR3, ACSL4, FABP3 (HinfI), FABP3 (BsrfI), PLIN2 107 Hình 3.45. Tỷ lệ mỡ giắt của các gen ADRB3, ACSL4, FABP3 (HinfI) và PLIN2 112 x
12. MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong những năm gần Ďây, sự phát triển nhanh chóng của lĩnh vực khoa học di truyền học phân tử Ďã Ďóng góp to lớn vào việc mở ra những hiểu biết sâu về bản chất di truyền ở mức Ďộ gen và hệ gen của nhiều Ďối tƣợng vật nuôi. Những phát hiện về một số gen hay chỉ thị di truyền có liên quan tới biểu hiện kiểu hình của một số tính trạng nhất Ďịnh Ďã mở ra triển vọng chọn giống vật nuôi thành công trên cơ sở các gen ứng viên. Hiện nay, các biện pháp chọn lọc với sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (Maker-Assisted Selection-MAS) dựa trên bản chất Ďa hình của ADN cho phép xác Ďịnh nhanh chóng các gen kiểm soát hình thành các tính trạng khác nhau của Ďộng vật cũng nhƣ năng suất của chúng (Ma và cs., 2017). Các phƣơng pháp này thể hiện ƣu Ďiểm vƣợt trội hơn so với các phƣơng pháp chọn lọc truyền thống dựa vào kiểu hình nhƣ giảm thời gian chọn lọc và có thể chọn lọc trên các tính trạng có hệ số di truyền thấp hay khó Ďánh giá, Ďo lƣờng kiểu hình hoặc rất tốn kém khi Ďánh giá qua kiểu hình. Có các cách xác Ďịnh chỉ thị phân tử nhƣ xác Ďịnh các locus tính trạng số lƣợng (QTL) và các alen liên kết với QTL; xác Ďịnh các gen ứng viên. Trong Ďó, cách tiếp cận bằng các gen ứng viên tập trung phân tích trực tiếp gen Ďể tìm mối liên kết giữa bản thân các gen ứng viên với kiểu hình. Những sai khác về kiểu hình thƣờng gây ra bởi những thay Ďổi sâu sắc về cấu trúc ADN ở các gen ứng viên Ďã và Ďang Ďƣợc nghiên cứu. Những thông tin hữu ích này sẽ Ďƣợc sử dụng cho các chƣơng trình chọn lọc dựa vào chỉ thị phân tử. Nhiều gen ứng viên liên quan Ďến tính trạng sinh trƣởng, chất lƣợng thịt Ďã Ďƣợc nghiên cứu và Ďề xuất sử dụng cho các chƣơng trình chọn lọc hỗ trợ bởi chỉ thị phân tử (MAS) nhƣ: gen PIT1 (Song và cs., 2005; Franco và cs., 2005; Feng và cs., 2012; Daga và cs., 2012; Kim và cs., 2014; Al- Khuzai và cs., 2018). Gen MC4R mã hoá cho thụ thể protein xuyên màng của tế bào. Thụ thể này Ďóng vai trò quan trọng trong việc Ďiều khiển lƣợng
13. thức ăn thu nhận, khối lƣợng cơ thể và duy trì ổn Ďịnh năng lƣợng nội bào. Gen MC4R có mối liên kết với tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng (Houston và cs., 2004; Kim và cs., 2006; Meidtner và cs., 2006; Maagdenberg và cs., 2007; Fan và cs., 2009; Kováčik và cs., 2009; Switonski và cs., 2010; Piórkowska và cs., 2010; Davoli và cs., 2012; Hirose và cs., 2014). Gen GH liên quan Ďến các tính trạng thân thịt và sinh trƣởng (Faria và cs., 2006; Bižienė và cs., 2011; Lyubov và cs., 2017). Gen LEP liên quan Ďến mức tăng khối lƣợng (Urban và cs., 2002; Tempfli và cs., 2015). Gen PIK3C3 liên quan Ďến tăng khối lƣợng trong giai Ďoạn trọng lƣợng cơ thể từ 30 - 90 kg (Hirose và cs., 2011). Các gen FABP3, ADRB3, PLIN2 và ACSL4 liên quan Ďến các tính trạng chất lƣợng thịt, là những gen có tiềm năng Ďể xây dựng thành các chỉ thị chọn lọc lợn thịt cho tỷ lệ mỡ giắt cao (Davoli và cs., 2011; Han và cs., 2012; Chen và cs., 2014; Xue và cs., 2015). Tuy nhiên, mối liên quan giữa Ďa hình gen với các tính trạng còn tùy thuộc vào Ďặc Ďiểm hay bản chất di truyền của từng quần thể lợn tại mỗi cơ sở chăn nuôi. Do Ďó, Ďể có thể ứng dụng các gen trong hỗ trợ chọn lọc theo từng tính trạng mong muốn cần có nghiên cứu Ďánh giá mối liên kết của các gen ứng viên trên quần thể cần chọn lọc. Lợn Duroc là một trong những giống lợn ngoại có khả năng tăng khối lƣợng nhanh, chất lƣợng thịt tốt (thịt mềm do mô mỡ xen lẫn với mô nạc) và tỷ lệ nạc cao. Chính vì vậy, ở Việt Nam, lợn Duroc Ďƣợc sử dụng trong các chƣơng trình nạc hóa Ďàn lợn, góp phần nâng cao năng suất và chất lƣợng thịt cho ngành chăn nuôi lợn thịt. Mặt khác, nhiều nghiên cứu cho thấy tăng khối lƣợng trên lợn Duroc ở Việt Nam không vƣợt trội so với tăng khối lƣợng trên lợn Duroc của một số nƣớc phát triển. Vì vậy, mục tiêu cải tạo khả năng tăng khối lƣợng, dày mỡ lƣng và nâng cao chất lƣợng Ďàn lợn Duroc nhằm góp phần Ďẩy mạnh ngành chăn nuôi lợn thịt Ďang trở thành hƣớng nghiên cứu quan trọng. 2
14. Để có cơ sở khoa học ứng dụng các chỉ thị di truyền trong việc hỗ trợ chọn lọc nâng cao khả năng tăng khối lƣợng và chất lƣợng thịt của Ďàn lợn Duroc nuôi tại Công ty TNHH lợn giống hạt nhân Dabaco, tôi nghiên cứu Ďề tài “Mối liên kết giữa đa hình một số gen ứng viên với tính trạng tăng khối lượng, dày mỡ lưng và tỷ lệ mỡ giắt ở lợn Duroc”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu chung Xác Ďịnh tính Ďa hình và mối liên kết giữa Ďa hình của một số gen ứng viên với tính trạng tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng, tỷ lệ mỡ giắt ở lợn Duroc nuôi tại Công ty TNHH lợn giống hạt nhân Dabaco. Từ Ďó, là cơ sở khoa học Ďể sử dụng các chỉ thị phân tử hỗ trợ chọn lọc và nhân giống vật nuôi. 2.2. Mục tiêu cụ thể Xác Ďịnh Ďƣợc tính Ďa hình các gen MC4R, PIT1, GH, LEP, PIK3C3 và mối liên kết với các tính trạng tăng khối lƣợng, dày mỡ lƣng, năng suất sinh sản ở lợn Duroc. Xác Ďịnh Ďƣợc tính Ďa hình các gen ADRB3, ACSL4, FABP3, PLIN2 và mối liên kết với tỷ lệ mỡ giắt ở lợn Duroc. Bƣớc Ďầu ứng dụng chọn lọc dòng lợn Duroc theo hƣớng tăng khối lƣợng cơ thể sử dụng sự hỗ trợ từ thông tin kiểu gen. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN Luận án cung cấp những thông tin về tần số kiểu gen, tần số alen và mối liên kết với tính trạng tăng khối lƣợng và dày mỡ lƣng, năng suất sinh sản, tỷ lệ mỡ giắt của một số gen ứng viên MC4R, PIT1, GH, LEP, PIK3C3, ADRB3, ACSL4, FABP3, PLIN2 trên lợn Duroc nuôi tại Công ty TNHH lợn giống hạt nhân Dabaco. Luận án Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng một số gen ứng viên Ďể hỗ trợ chọn lọc lợn Duroc có khả năng tăng khối lƣợng, dày mỡ lƣng và tỷ lệ mỡ giắt tại Công ty TNHH giống lợn hạt nhân Dabaco. 3
15. Các bài báo Ďăng trên tạp chí khoa học trong và ngoài nƣớc là những tƣ liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu khoa học và giảng dạy. 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Luận án là công trình khoa học nghiên cứu một cách hệ thống bao gồm: phân tích Ďa hình các gen ứng viên MC4R, PIT1, GH, LEP, PIK3C3, ADRB3, ACSL4, FABP3, PLIN2; Ďánh giá mối liên kết giữa Ďa hình các gen này với năng suất sinh trƣởng, dày mỡ lƣng và tỷ lệ mỡ giắt; ứng dụng chọn lọc lợn Duroc có khả năng tăng khối lƣợng cao dựa trên thông tin các gen ứng viên tại Công ty TNHH lợn giống hạt nhân Dabaco. Cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh hƣớng sử dụng các chỉ thị phân tử hỗ trợ chọn lọc nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng thịt trong chăn nuôi Ďối với giống lợn Duroc, từ Ďó rút ngắn thời gian chọn lọc và nâng cao hiệu quả chăn nuôi, góp phần Ďáp ứng yêu cầu sản xuất chăn nuôi lợn năng suất, chất lƣợng cao ở nƣớc ta. 4
16. CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1.1. Chọn lọc giống vật nuôi dựa vào sự hỗ trợ của gen ứng viên và chỉ thị di truyền Cải tiến di truyền qua chọn lọc Ďã góp phần quan trọng trong cải tiến năng xuất vật nuôi trong nhiều thập kỷ năm qua. Theo phƣơng pháp truyền thống, các giống vật nuôi Ďƣợc chọn lọc qua kiểu hình, hệ phả và Ďánh giá giá trị giống nhờ vào sự sai khác mong Ďợi qua các thế hệ sau. Hầu hết các tính trạng kinh tế là những tính trạng phức tạp Ďƣợc kiểm soát bởi nhiều gen và bị ảnh hƣởng bởi nhân tố môi trƣờng. Một gen là một Ďoạn axit deoxyribonucleic (ADN) Ďƣợc tạo nên từ các cặp của 4 nucleotid (A, C, G, T). Một gen mã hóa cho một protein Ďặc hiệu. Nó có thể xẩy ra sự thay Ďổi Ďối với trình tự ADN ở một gen và trình tự này có sự khác biệt giữa các cá thể. Những sự khác biệt này trong một gen Ďƣợc gọi là alen và dẫn tới sự khác nhau về số lƣợng và các dạng protein Ďƣợc mã hóa từ các gen Ďó. Protein Ďƣợc tạo ra từ các alen khác nhau, có thể ảnh hƣởng Ďến sự biểu hiện của một tính trạng xác Ďịnh và ảnh hƣởng tới năng suất quan sát. Gần Ďây Ďã có khá nhiều công bố về gen ứng viên liên quan Ďến các tính trạng năng suất, chất lƣợng và khả năng kháng bệnh nhƣ: gen ESR, PRLR FSHB, RNF4 và RBP4 liên quan tới tính trạng sinh sản ở lợn; gen, MC4R, PIT1, GH, LEP, PIK3C3 liên quan Ďến tính trạng năng suất thịt ở lợn; gen ADRB3, ACSL4, FABP3, PLIN2 liên quan Ďến tính trạng chất lƣợng thịt ở lợn; gen FUT1, MUC liên quan Ďến khả năng kháng bệnh Chỉ thị di truyền hoặc chỉ thị phân tử hay chỉ thị ADN (Genetic Marker hoặc Molecular Marker hay ADN marker) là một gen hoặc trình tự ADN tại một vị trí Ďã biết trên một nhiễm sắc thể Ďƣợc sử dụng Ďể xác Ďịnh cho các cá thể hoặc loài vật nuôi. Chỉ thị di truyền có thể là một trình tự 5
17. ADN ngắn, chẳng hạn một trình tự xung quanh một Ďa hình nucleotide Ďơn hoặc một trình tự dài nhƣ là minisatellite (Wikipedia). Kor và cs. (2014) cho rằng các chỉ thị di truyền Ďƣợc xem nhƣ những “dấu chuẩn” trong bộ gen, có thể so sánh các con vật với nhau trên cơ sở những “dấu chuẩn” này. Bốn ứng dụng quan trọng của chỉ thị di truyền trong chọn giống vật nuôi là: 1) Kiểm tra hệ phả thông qua việc xác Ďịnh chính xác Ďƣợc bố của con vật; 2) Tìm ra các alen có ảnh hƣởng thuận lợi trong chọn giống. Nhiều chỉ thị di truyền liên kết chặt chẽ với một locus tính trạng số lƣợng (Quantitative Trait Locus, QTL) ảnh hƣởng tới nhiều tính trạng của vật nuôi; 3) Tìm kiếm các alen có ảnh hƣởng xấu tới vật nuôi, chẳng hạn các khuyết tật di truyền do một gen lặn gây ra từ Ďó có thể chọn lọc Ďể loại bỏ ảnh hƣởng của các gen này trong Ďàn vật nuôi và 4) Tham gia vào chọn lọc bộ gen. Gần Ďây các nhà khoa học Ďã bắt Ďầu nhận dạng các vùng ADN có ảnh hƣởng tới các tính trạng. Họ Ďã sử dụng kỹ thuật phân tử Ďể xác Ďịnh những Ďa hình di truyền trong trình tự các cặp bazơ tại những vùng này. Thí nghiệm Ďã phát triển Ďể nhận biết những sai khác tinh vi (khó phát hiện ra). Điều này cho phép phát triển các chỉ thị di truyền mà có thể sử dụng Ďể nhận biết một cá thể Ďang mang một Ďoạn ADN gắn với tính trạng quan tâm có biểu hiện hay không biểu hiện. Các chỉ thị di truyền ở một vùng xác Ďịnh trên phân tử ADN có thể chỉ khác nhau ở một căp bazơ. Những sai khác nhƣ vậy Ďƣợc gọi là Ďa hình nucleotide Ďơn hay SNPs. Các thử nghiệm dựa vào SNPs phân tích ADN bắt nguồn từ một các thể Ďể xác Ďịnh trình tự ADN có mặt ở một vị trí Ďặc hiệu (cặp nucleotide). Phân tích kiểu gen (genotyping) là một thuật ngữ Ďƣợc sử dụng Ďể mô tả quá trình mà Ďƣợc sử dụng trong các phƣơng pháp phòng thí nghiệm Ďể xác Ďịnh trình tự các nucleotide trong Ďoạn ADN từ một cá thể, thƣờng ở một của gen riêng biệt hoặc một vị trí Ďặc hiệu trong hệ gen. Chọn lọc một cá thể có chỉ thị mang gen biểu hiện có lợi lên tính trạng quan tâm, có 6
18. thể dẫn tới sự thay Ďổi kiểu hình quan sát. Mặc dù các tính trạng phức tạp bị chi phối bởi nhiều gen, tuy nhiên kiểu di truyền của mỗi chỉ thị là Ďơn giản, mỗi cá thể có một alen chỉ thị từ bố hoặc mẹ. Chọn lọc dựa vào sự hỗ trợ của chỉ thị di truyền là phƣơng pháp sử dụng các kết quả phân tích ADN Ďể giúp cho sự chọn lọc cá thể từ bố mẹ cho tới các thế hệ tiếp theo trong chƣơng trình cải tiến di truyền. Phân tích kiểu gen cho phép phát hiện chính xác các dạng ADN Ďặc hiệu mà ảnh hƣởng lên các tính trạng phức tạp. Các chỉ thị của các tính trạng phức tạp Ďƣợc kết hợp với chỉ một gen trong nhiều gen mà di truyền theo hƣớng tính trạng Ďó. Chọn lọc dựa vào sự hỗ trợ của chỉ thị di truyền có hiệu quả nhất Ďối với các tính trạng có các Ďặc Ďiểm sau: khả năng di truyền thấp; khó khăn và tốn kém Ďể Ďánh giá; tính trạng biểu hiện muộn không thể Ďánh giá cho tới khi cá thể Ďã di truyền cho các thế hệ tiếp theo; hiện tại không Ďƣợc chọn lọc vì không Ďƣợc Ďánh giá Ďều Ďặn. 1.1.2. Một số phương pháp nghiên cứu đa hình di truyền Với sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử, các chỉ thị phân tử ADN Ďã có những tiến bộ nhanh chóng. Chỉ thị phân tử ADN Ďƣợc áp dụng khá rộng rãi trong nghiên cứu Ďa hình di truyền phục vụ cho công tác chọn giống, nghiên cứu tiến hoá và phân loại học, dựa trên những Ďặc tính của phân tử ADN (tính Ďa dạng, ổn Ďịnh và Ďặc trƣng cho cá thể và cho loài, ). Các phƣơng pháp nghiên cứu Ďa hình di truyền dựa trên chỉ thị phân tử ADN phổ biến nhƣ: 1.1.2.1. Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction fragment length polymorphism- RFLP) Kỹ thuật cơ bản trong xác Ďịnh RFLP Ďƣợc tiến hành theo các bƣớc cắt mẫu ADN bằng enzyme cắt giới hạn, là các enzyme nhận biết và cắt một Ďoạn ADN ngắn Ďặc hiệu. Các mảnh ADN tạo ra sau Ďó Ďƣợc phân 7
19. tách bằng quá trình Ďiện di trên gel agarose và Ďƣợc chuyển lên màng lai thông qua quy trình lai Southern. Kết quả của quá trình là tạo ra hình ảnh các phân Ďoạn ADN khác nhau. Các hình ảnh phân Ďoạn ADN khác nhau này Ďƣợc tạo nên do sự thay thế, thêm vào hay bớt Ďi của các nucleotide hoặc do Ďa hình nucleotide Ďơn. Phƣơng pháp này Ďƣợc ứng dụng trong lập hồ sơ di truyền, lập bản Ďồ hệ gen, phân tích bệnh di truyền và xét nghiệm phả hệ. RFLP là công nghệ nghiên cứu Ďa hình ADN Ďầu tiên Ďƣợc ứng dụng một cách rộng rãi vì có Ďộ tin cậy cao, bởi nó Ďƣợc tạo ra từ các vị trí cụ thể thông qua các enzyme hạn chế Ďã biết và kết quả không Ďổi theo thời gian và vị trí. Kết quả nghiên cứu có thể phân biệt dị hợp tử với Ďồng hợp tử. Hạn chế của RFLP như sau: RFLP chỉ có thể kiểm tra các Ďột biến cụ thể tại các vị trí cắt enzyme, Ďiều này hạn chế việc xác Ďịnh toàn bộ biến Ďổi gen ở Ďộng vật. Tính Ďa hình của các dấu RFLP tƣơng Ďối thấp và phải Ďƣợc phát hiện bởi Ďồng vị phóng xạ, Ďiều này làm hạn chế ứng dụng của nó. Ngày nay, kỹ thuật này Ďã trở nên lỗi thời và bị thay thế bởi công nghệ giải trình tự. Tuy nhiên, RFLP vẫn là một kỹ thuật Ďƣợc sử dụng trong lựa chọn hỗ trợ marker. 1.1.2.2. Kỹ thuật PCR-RFLP PCR là một kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân bản một Ďoạn ADN mong muốn từ hệ gen ADN của sinh vật thành nhiều bản sao ở bên ngoài tế bào. RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính Ďa hình chiều dài của các phân Ďoạn ADN dựa trên Ďiểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE). Phƣơng pháp PCR-RFLP Ďƣợc phát minh dựa trên kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction,) Ďƣợc ứng dụng Ďể xác Ďịnh Ďa hình gen của các gen ứng viên. 8
20. Sau khi nhân Ďoạn ADN nhờ một cặp mồi Ďặc hiệu, sản phẩm PCR Ďƣợc cắt bằng một enzyme giới hạn. Sau khi phân tích các sản phẩm cắt bằng Ďiện di trên gel agarose có thể thấy Ďƣợc sự thay thế các bazơ nitơ hay sự thay Ďổi trật tự các bazơ nitơ tại vị trí cắt trên ADN Ďƣợc nhân lên. Nguyên tắc của phƣơng pháp là tạo lƣợng lớn các Ďoạn ADN Ďặc thù từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt Ďộng của ADN polymerase Ďể tổng hợp sợi mới bổ sung. Các yếu tố cơ bản Ďể thực hiện phản ứng PCR bao gồm: - Sợi khuôn ADN chỉ cần biết trình tự nucleotide của Ďoạn nhỏ nằm cạnh Ďoạn cần nhân Ďể thiết kế hai mồi oligonucleotide. - Hai Ďoạn mồi ngắn Ďể xác Ďịnh các Ďiểm bắt Ďầu tổng hợp ADN. Là tín hiệu chỉ hƣớng Ďi (5’→3’) của enzyme ADN polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai Ďầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung. - Có Ďầy Ďủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP. - Môi trƣờng Ďệm cung cấp ion Mg và nƣớc tinh khiết không có enzyme RNase và DNase. - Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl Ďến 50 µl. Phƣơng pháp này Ďƣợc áp dụng khá phổ biến trên nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới do phát hiện Ďa hình tƣơng Ďối cao, dễ tiến hành, chi phí thấp. Kỹ thuật PCR Ďƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu khoa học Ďến sản xuất và Ďời sống xã hội. Xác Ďịnh các Ďoạn trình tự cần nghiên cứu; Phát hiện Ďột biến; Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử; Phục hồi các gen Ďã tồn tại hàng triệu năm; Chọn giống vật nuôi, cây trồng; 9
21. Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn; Xác Ďịnh các loài mới, các loài Ďặc hữu bằng phƣơng pháp di truyền phân tử; Y học - Khoa học hình sự. Chuẩn Ďoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus; Chuẩn Ďoán sớm các bệnh gây ra do ung thƣ, các bệnh di truyền; Xác Ďịnh huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm. 1.1.2.3. Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (Amplified fragment length polymorphism - AFLP) Kỹ thuật AFLP Ďƣợc sử dụng Ďể phát hiện Ďa hình ADN. Phân tích AFLP Ďƣợc kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi hay còn gọi là chuỗi tiếp hợp (adapter) Ďể nhân chọn lọc các phân Ďoạn ADN Ďƣợc cắt hạn chế. Các cặp mồi thƣờng tạo Ďƣợc từ 50 - 100 băng trong một phân tích. Mỗi Ďoạn bao gồm một phần cố Ďịnh dài hơn 15 bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một phần thay Ďổi ngắn 2 - 4 bp. Phần cố Ďịnh dài tạo ra sự ổn Ďịnh của sản phẩm và phần thay Ďổi ngắn tạo ra nhiều locus, có thể trên 100 locus với một tổ hợp mồi AFLP. Sự Ďa hình Ďƣợc xác Ďịnh bằng sự có mặt hoặc không có mặt của một phân Ďoạn ADN. Sản phẩm PCR sau Ďó Ďƣợc phân tách trên gel có Ďộ phân giải trình tự cao và có thể nhìn thấy bằng phóng xạ tự chụp. Nếu không sử dụng nucleotit Ďƣợc Ďánh dấu phóng xạ, có thể sử dụng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang hoặc nhuộm bạc Ďể quan sát sản phẩm. Kỹ thuật này gồm bốn bƣớc: Cắt ADN hệ gene bằng enzyme giới hạn và gắn các oligonucleotide tiếp hợp (adapter). Khuếch Ďại tiền chọn lọc bằng cặp mồi tiền chọn lọc. Khuếch Ďại chọn lọc sử dụng các tổ hợp mồi EcoRI và MseI chọn lọc khác nhau. Phân tích trên gel các Ďoạn ADN Ďƣợc nhân lên. 10
22. Ưu điểm của kỹ thuật AFLP: AFLP không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát Ďƣợc toàn bộ gen. Có tính lặp lại cao hơn RAPD và chỉ cần sử dụng một lƣợng nhỏ ADN ban Ďầu. Khuếch Ďại có chọn lọc một lƣợng lớn các Ďoạn ADN Ďa hình (polymorphism) trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích Ďa dạng giữa các quần thể có quan hệ gần nhau. Không cần biết trƣớc trình tự ADN của gen cần nghiên cứu, không cần sử dụng nhiều loại mồi. Là kỹ thuật in dấu ADN còn khá mới lạ nhƣng rất hiệu quả, có thể in dấu ADN của bất kỳ nguồn gốc phức tạp nào từ sinh vật nhân sơ, thực vật, Ďộng vật Ďến con ngƣời. Hạn chế của kỹ thuật AFLP: AFLP là một marker trội, Ďiều này làm hạn chế phân biệt cá thể Ďồng hợp và dị hợp. Quy trình dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực hiện. Lệ thuộc nhiều vào thao tác ở những bƣớc Ďầu Ďể có Ďƣợc phổ diện các phân Ďoạn ADN lý tƣởng. Ứng dụng của kỹ thuật AFLP: In dấu ADN, lập bản Ďồ ADN marker hiệu quả nhất so với những marker khác. Tạo nhóm liên kết di truyền giữa các giống. Đánh giá mức Ďộ liên hệ di truyền hoặc sự khác nhau giữa các giống. Là công cụ hiệu quả Ďể phát hiện tính chất Ďa hình nên dễ dàng nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể. 1.1.2.4. Kỹ thuật vị trí chuỗi đánh dấu (Sequence Tagged Sites-STS) Khái niệm STS Ďƣợc Ďƣa ra bởi Olson và cs., 1989 khi Ďánh giá tác Ďộng có khả năng xảy ra của phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Ďối với 11